中华人民共和国国家标准
GB/T21312-2007
动物源性食品中14种喹诺酮药物残留 检测方法液相色谱-质谱/质谱法
Analysis of fourteen quinolones in food of animal origin byhigh performance liquid chromatography tandem massspectrometry
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E均为资料性附录，
本标准由中国国家标准化管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所.
本标准主要起草人：杨奕、国伟、吴永宁、彭涛、邵兵、李晓娟、代汉慧.
本标准首次发布.
动物源性食品中14种喹诺酮药物残留 检测方法液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了动物源性食品中14种喹诺酮药物残留量检测的制样方法和高效液相色谱-质谱/质谱检测方法.
本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾、牛奶、鸡蛋等动物源性食品中恩诺沙星、诺氟沙星、培氯沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、洛美沙星、吡哌酸、萘啶酸、奥索利酸、氟甲噬、西诺沙星、单诺沙星 14种喹诺酮类兽药残留量的液相色谱-质谱/质谱法测定和确证.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992neqISO3696：1987)
3方法提要
用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲液（pH4.O）提取样品中的喹诺酮类抗生素，经过滤和离心后，上清液经HLB固相萃取柱净化.高效液相色谱-质谱/质谱测定，用阴性样品基质加标外标法定量.
4制样方法
制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化.
4.1动物肌肉和动物内脏
将现场采集的样品放人小型冷冻箱中运输到实验室，在一10℃以下保存，一周内进行处理.取适量新鲜或冷冻解冻的动物组织样品去筋、将碎均匀.
4.2牛奶
新鲜或冷冻解冻的样品混合均匀. 将现场采集的样品放人小型冷冻箱中运输到实验室，在一10℃以下保存，一周内进行处理.取适量
4.3鸡蛋
将现场采集的样品放人小型冷冻箱中运输到实验室，在一10℃以下保存，一周内进行处理.取适量新鲜的样品，去壳后混合均匀.
5试剂和材料
除特殊注明外，本法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水.
5.1柠檬酸：分析纯.5.2磷酸氢二钠：分析纯. 5.3甲醇.5.4乙睛.5.5甲醇-乙晴溶液：4060（体积比）.
5.6甲酸（99%）.5.7氢氧化钠：分析纯.5.9磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L.称取71.63g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL. 5.8乙二胺四乙酸二钠：分析纯.5.10柠檬酸溶液：0.1mol/L.称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL.5.11Mcllvaine缓冲溶液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液（5.10)与625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（5.9）混合，必要时用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0土0.05.5.12EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1mol/L.称取60.5g乙二胺四乙酸二钠（5.8）放入1625mL Mellvaine缓冲溶液（5.11)中，振摇使其溶解.5.13甲醇水溶液：5%（体积分数）.5.14甲酸水溶液：0.2%（体积分数）.5.15喹诺酮类药物标准物质：恩诺沙星（enrofloxacin，CAS：93106-60-6）、诺氟沙星（norfloxacin， CAS：70458-96-7）、培氟沙星（pefloxacin，CAS：6159-55-3）、环丙沙星（ciprofloxacin，CAS：85721-33-1)、氧氟沙星（oflaxacin CAS;82419-36-1）、沙拉沙星（sarafloxacin CAS;98105-99-8）、依诺沙星（enoxacin，CAS:74011-58-8)、洛美沙星（lomefloxacin CAS 98079-51-7)、毗账酸（pipemdilic acid CAS; 51940-44-4)、茶啶酸（nalidixic acid，CAS：389-08-2）奥索利酸（oxolinie acid，CAS：14698-29-4）、氨甲（flumequineCAS:42835-25-6)、西诺沙星(cinoxacin， CAS: 28657-80-9)、单诺沙星(danofloxacin.CAS: 74011-58-8) （纯度>99%）5.16标准溶液5.16.1标准储备液：分别称取0.0100g标准品（5.15）置于10.0mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，标准储备液浓度为1mg/mL，一20C冰箱中保存，有效期3个月.5.16.2标准工作液：将以上各标准储备液（5.16.1）稀释，配成混合标准溶液，各组分浓度为10pg/ml. 此标准工作液于4℃保存，可保存3个月.5.17HLB固相萃取柱（200mg：6mL）或其他等效柱.
6仪器
6.1高效液相色谱-串联质谱仪. 6.2电子天平：感量0.0001g.6.3电子天平：感量0.01g.6.4组织匀浆机.6.6冷冻离心机（最高转速大于1000r/min）. 6.5旋涡混合器.6.7聚丙烯离心管（50mL).6.8酸度计（0.01）.6.9氮吹仪.6.10固相萃取仪.
7提取及净化
7.1提取
7.1.1动物肌肉组织、肝脏、肾脏
称取均质试样5.0g（精确到0.1g），置于50mL聚丙烯离心管中，加人20mL0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶液（5.12），1000r/min旋涡混合1min，超声提取10min，10000r/min离心5min（温度低于5℃），提取三次，合并上清液.
7.1.2牛奶和鸡蛋
称取均质试样5.0g（精确到0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中.用40mL0.1mol/LEDTA-Mellvaine缓冲溶液（5.12）溶解，1000r/min旋滨混合1min，超声提取10min，10000r/min离心10min（温度低于5℃），取上清液.
7.2净化
HLB固相萃取柱（200mg，6mL)，使用时用6mL甲醇洗涤、6mL水活化.将7.1提取的溶液以2mL/min~3mL/min的速度过柱，弃去滤液，用2mL5%甲醇水溶液（5.13）淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用6mL甲醇洗脱并收集洗脱液.洗脱液用氮气吹干，用1mL0.2%甲酸水溶液（5.14）溶解，1000r/min旋涡混合1min，用于上机测定.
7.3基质加标标准工作曲线的制备
将混合标准工作液（5.16.2）用初始流动相逐级稀释成2.5μg/L~100.0μg/L的标准系列溶液.称取与试样基质相应的阴性样品5.0g，加人标准系列溶液1.0mL，按照7.1、7.2与试样同时进行提取和净化.
8高效液相色谱-质谱/质谱测定
8.1高效液相色谱条件
8.1.1色谱柱：Waters ACQUITYUPLCTBEHC柱（100mm×2.1 mm，1.7μm）或其他等效柱.8.1.2流动相：A[4060甲醇-乙溶液（5.5）]；B[0.2%甲酸水溶液（5.14）]梯度淋洗，参考梯度条件见表B.18.1.3流速：0.2mL/min.8.1.4柱温：40C. 8.1.5进样体积：20gl
8.2质谱条件
电离模式：电喷雾电离正离子模式（ESI）：质谱扫描方式：多反应监测（MRM）：分辨率：单位分辨率：其他参考质谱条件见附录A
9空白试验
除不加标准外，均按上述步骤进行测定.
10结果计算与表述
10.1定性标准
10.1.1保留时间
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在士2.5%之内，参考保留时间见表B.2.
10.1.2信噪比
待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥10）.
10.1.3定量离子、定性离子及子离子丰度比
每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，面且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表1规定的范围.各化合物的参考质谱图和标准溶液色谱图见附录C，附录D.
