中华人民共和国国家标准
GB/T21317-2007
动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 与高效液相色谱法
Determination of tetracyclines residues in food of animal originLC-MS/MSmethod and HPLC method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：岳振峰、谢丽琪、叶卫翔、吉彩宽、林秀云、邱月明、赵风娟、陈沛金、周亚.本标准系首次发布.
动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 与高效液相色谱法
1范围
本标准规定了动物源性食品中四环素类兽药残留量检测的制样方法、高效液相色谱检测方法和液相色谱-质谱/质谱确证方法.
去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素7种四环素类兽药残留量的高效液相色谱测定和二甲胺 本标准适用于动物肌肉、内脏组织、水产品、牛奶等动物源性食品中二甲胺四环素、土霉素、四环素、四环素、差向土霉素、土霉素、差向四环素、四环素、去甲基金霉素、差向金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素10种四环素类药物残留量的液相色谱-质谱/质谱测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992neqISO3696：1987）
3原理
试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/LNaEDTA-Mcllvaine缓冲液（pH=4.0士0.05）提取，经过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪或液相色谱电喷雾质谱仪测定，外标峰面积法定量.
4试荆和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：高效液相色谱纯.4.3乙酸乙酯. 4.2乙腊：高效液相色谱纯.4.4乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA2HO).4.5三氟乙酸.4.6柠檬酸（CHO;HO）.4.8柠檬酸溶液：0.1mol/L.称取21.01g柠檬酸（4.6），用水溶解，定容至1000mL. 4.7磷酸氢二钠（NaHPO12HO）.4.9磷酸氢二钠溶液：0.2mol/1.称取28.41g磷酸氢二钠（4.7）.用水溶解，定容至1000ml.4.10Mcllvaine 缓冲溶液：将 1 000mL 0. 1 mol/L柠檬酸溶液（4.8）与 625 mL 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液（4.9）混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH=4.0土0.05.4.11NaEDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1mol/L.称取60.5g乙二胺四乙酸二钠（4.4）放人 1625mLMellvaine缓冲溶液（4.10）中，使其溶解摇匀.4.12甲醇水（119）：量取5mL甲醇（4.1）与95mL水混合.
GB/T 21317-2007
号（）06与（）由01（61）由14.14Oasis HLB固相萃取柱：60mg，3mL，或相当者.使用前分别用5mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润.4.15三氟乙酸水溶液（10mmol/L）：准确吸取0.765mL三氟乙酸于1000mL容量瓶中，用水溶解并 定容至刻度.4.16甲醇三氟乙酸水溶液（119）：量取50mL甲醇（4.1)与950mL三氟乙酸水溶液（4.15）混合.4.17标准物质：二甲胺四环素（minocycline.CAS：10118-90-8），土霉素（oxytetracycline，CAS:6153-64-6），四环素（tetracyeline，CAS：60-54-8），去甲基金霉素（demeclocycline，CAS：127-33-3），金霉素（chlortetracycline，CAS：57-62-5），甲烯土霉素（methacycline CAS:914-00-1)，强力霉素（doxyeycline，CAS：564-25-0），差向四环素（4-epitetracyclineCAS：64-75-5），差向±霉素（4-epioxytetracycline，CAS：35259-39-3），差向金霉素（4-epichlortetracycline，CAS：14297-93-9).纯度均大于等于95%.
4.18标准溶液
4.18.1标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基 金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素、差向土霉素、差向四环素和差向金霉素各10.0mg，分别用甲醇溶解并定容至100mL，浓度相当于100mg/L.储备液在-18C以下贮存于棕色瓶中，可稳定12个月以上.
4.18.2混合标准工作溶液：根据需要，用甲醇三氟乙酸水溶液（4.16）将标准储备溶液（4.18.1）配制为适当浓度的混合标准工作溶液，混合标准工作溶液应使用前配制.
5仪器
5.1液相色谱中联四极杆质谱仅或相当者，配电喷雾离子源.5.2高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器或紫外检测器.5.3分析天平：感量0.1mg，0.01g.5.4旋涡混合器. 5.5低温离心机：最高转速5000r/min，控温范围为一40C至室温.5.6吹氮浓缩仪.5.7固相萃取真空装置.5.8pH计：测量精度士0.02.5.9组织捣碎机.5.10超声提取仪.
6样品制备与贮存
制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化.
6.1动物肌肉、肝脏、肾脏和水产品
于一18C以下冷冻存放. 从所取全部样品中取出约500g，用组织接碎机充分捣碎均匀，装人洁净容器中，密封，并标明标记，
6.2牛奶样品
从所取全部样品中取出约500g，充分混匀，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18C以下冷冻存放.
7测定步骤
7.1提取
7.1.1动物肝脏、肾脏、肌肉组织、水产品
称取均质试样5g（精确到0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，分别用约20mL、20mL、10mL0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶液（4.11)冰水浴超声提取三次，每次旋涡混合1min，超声提取10min，3000r/min离心5min（温度低于15C），合并上清液（注意控制总提取液的体积不超过50 mL)，并定容至50mL，混匀，5000r/min离心10min（温度低于15C），用快速滤纸过滤，待净化.
7.1.2牛奶
称取混匀试样5g（精确到0.01g）.置于50mL比色管中，用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶液（4.11）溶解并定容至50mL，旋涡混合1min，冰水浴超声10min，转移至50mL聚丙烯离心管中，冷却至0C~4C，5000r/min离心10min（温度低于15C），用快速滤纸过滤，待净化.
7.2净化
准确吸取10mL提取液（相当于1g样品）以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱（4.14)，待样液完全流出后，依次用5mL水和5mL甲醇水（4.12）淋洗，弃去全部流出液.2.0kPa以下减压抽干5min，最后用10mL甲醇乙酸乙酯（4.13）洗脱.将洗脱液吹氮浓缩至干（温度低于40C）.用1.0mL（液相色谱-质谱/质谱法）或0.5mL（高效液相色谱法）甲醇三氟乙酸水溶液（4.16）溶解残渣，过0.45μm滤膜，待测定.
7.3测定
7.3.1液相色谱-质谱/质谱法
7.3.1.1液相色谱条件
a）色谱柱：lnertsilC8-3，5 ym，150mm×2.1mm（内径），或相当者；b）流动相：甲醇（4.1）10mmol/L三氟乙酸（4.15）.梯度洗脱（梯度时间表见表1）；
表1分离10种四环素类药物的液相色谱洗脱梯度
时网/min 甲醇/% 10mmol/1.三氟乙酸/%0 5:0 95. 05 0 30 0 70 010 0 3. 5 66 512 0 65 0 35. 017.5 65 0 35.018 0 5 0 95 025.0 5. 0 95. 0
c）流速：300yL/min;e）进样量：30pL. d）柱温：30C；
7.3.1.2质谱条件
离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI十）：质谱扫描方式：多反应监测（MRM）：分辨率：单位分辨率：其他参考质谱条件见附录A.
7.3.1.3定性测定
7.3.1.3.1保留时间
待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在土2.5%之内.
