中华人民共和国国家标准
GB/T21330-2007
Method for the determination of streptomycin residues in aminal original foodEnzyme-linked immunosorbent assay
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局.本标准主要起草人：施伟良、张晓峰、朱振江、蔡昊雁、吴.本标准系首次发布的国家标准.
动物源性食品中链霉素残留量测定方法 酶联免疫法
1范围
本标准规定了肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中链霉素残留量的酶联免疫测定方法.本标准适用于肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中链霉素残留量的测定.本标准的方法检出下限：肉类、内脏和水产品为50.0μg/kg；牛奶和奶粉为20.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注明日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379（部分）测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987）
3原理
准品或样品提取液后，特异性抗体与包被的绵羊抗兔IgG抗体结合，同时游离链霉素和酶标记链霉素 微孔板中包被有绵羊抗兔1gG抗体，加人特异性抗体（免抗链霉素抗体）、酶标记链霉素、链霉素标竞争性的与特异性抗体结合.通过洗涤除去未结合的链霉素和酶标记链霉素，然后加人底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中链霉素的含量.
除去另外说明外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1链霉素检测试剂盒（组成参见附录A）.4.2三氯乙酸.4.4氯化钾. 4.3氯化钠.4.5磷酸二氢钾.4.6磷酸氢二钠.4.7磷酸二氢钠.4.8吐温-80.4.10PBS缓冲液：8.5g氯化钠，1.15g磷酸氢二钠.0.27g磷酸二氢钠，用水定容至1L 4.93%三氧乙酸：称取3g三氯乙酸（4.2），用水定容至100mL.温-80，用水定容至1L4.12正已烷. 4.13链霉素标准物质：纯度大于等于98%.4.14链霉素标准品溶液的配制：用灭菌水作为溶剂配制成25mg/mL的储存液，于一20C条件下保存.
5仪器
5.1酵标仪. 5.28道移液器：50gL~300L5.3单道移液器:5μL~50 yL 100 μL~1 000μL 和 2 mL~10 mL 5.4混合振荡器.5.5离心机.5.6具塞试管：20mL50ml.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
对组织样品：从全部样品中取有代表性样品，混匀，用四分法缩分出不小于1000g试样，去除脂肪、充分纹碎、混匀、分装、密封，并加以标识.
对牛奶和奶粉：从原始包装中取有代表性样品，充分混匀，用四分法缩分出不小于500g试样，装人清洁密闭容器，加封后标明标记.
6.2试样的保存
将样品于-18C~-20C条件下保存.
7分析步骤
7.1提取
7. 1.1组织
振荡10 min 加人10 mL的3%三氧乙酸（4. 9）涡旋10min，6.000 r/min 离心15min，取3mL上清液 称取2.5g去脂肪均质样品，精确到0.1g，置于50mL具塞试管中，加人5mLPBS缓冲液（4.10）于干净试管中，再加人2mL正已烷（4.12）；3000r/min离心10min，吸取150L下层液体加950gL的SDB（4.11）缓冲液，调节pH至7.5左右.最后稀释倍数为50.
7.1.2牛奶
牛奶样品先离心去脂肪，然后以SDB缓冲液（4.11）直接做10倍稀释：对于奶粉则可以先用与样品右，最后稀释倍数为10.
7.2测定条件
7.2.1酶标仪测定条件
酶标仪测定波长为450nm.
7.2.2洗板条件
7.2.2.1人工洗涤次数5次以上，每次注水量为250gL.7.2.2.2自动洗板可以预定5次周期.
7.2.3操作条件
24C）后方可使用.
7.3测定步骤
7.3.1将测定需用的微孔板备齐并插人微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置.
1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可.如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用.
7.3.2吸取100gL零浓度标准品于孔A1、A2；并吸取50L零浓度标准品于孔B1、B2；分别吸取50pL链霉素标准溶液（浓度分别为：0.25、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0ng/mL）于孔C1、C12-H1、H2：吸取50pL样品溶液于其余微孔中.
7.3.3分别吸取25L链霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔.
7.3.4分别吸取25L链霉素抗体溶液于除A1、A2外的每一个微孔.
7.3.5用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀.
7.3.6将酶标板置于4C避光孵育1h，
7.3.7倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干 燥.再立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板.要注意不能使微孔干燥.
20C~24C避光孵育30min.
7.3.9迅速加人100pL反应终止液于每一个微孔，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔 架置于酶标仪中，在450nm处测量吸光度（加人反应终止液后应在30min内读取吸光度）.
注：测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头.
7.4平行试验
按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定.
7.5空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行.
7.6监控试验
每次测定均应做一个添加链霉素标准（4.14）的样品，添加浓度为相应产品的最高残留限量.
8结果计算
从含有标准品和样品的板孔的吸光度（OD）值中，减去空白孔A1、A2的平均OD值.标准品和样品的OD平均值除以零标准（B1、B2）的平均OD值，再乘以100.零标准为100%（最大吸光度值），其他OD值为最大吸光度值的百分数.
工作曲线.从标准工作曲线上得到试样中相应的链霉素浓度后，结果按式（1）进行计算：
x=cXV×1000×1 000 .....( 1)
式中：
X-样品中链霉素的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）：c-从标准工作曲线上得到的样品中链霉素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；m-样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g）.
注：也可以用各种酶标仅的数据处理软件进行计算.所得结果表示至一位小数.
9确证试验
如被测样品中链霉素残留量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证.回收率参见附录B.
