中华人民共和国国家标准
GB/T22917-2008
Protocol of fluorogenic RT-PCR for swine vesicular disease virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》（第5版）.
本标准的附录A为规范性附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口.
疫局. 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检
本标准主要起草人：花群义、卢体康、吕建强、阮周曦、杨云庆、周晓黎、杨素、董俊、陈书琨.
猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法
1范围
本标准规定了猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的操作方法.本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测.
2缩略语
下列缩略语适用于本标准.
荧光反转录-聚合酶链反应.
2.2Cr值每个反应管内的荧光信号达到设定的闺值时所经历的循环数.
2.3 RNA核糖核酸.
2.4 DEPC 焦碳酸磷酯.
2.5 PBS磷酸盐缓冲盐水，配方见附录A.
3原理
根据猪水泡病病毒的基因特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针.引物和探针通过严格的设计和筛选，涵盖已报道的猪水泡病病毒的毒株.荧光探针的5'端标记FAM荧光素，3'端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'编报告荧光基团发出的荧光信号.扩增时，由于Tag酶的5'→3'的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信 号产生.因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测.
4材料与试剂
4.1仪器与器材
4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）. 4.1.1荧光RT-PCR检测仪.4.1.3台式离心机或手掌式离心机（离心速度3000r/min）.4.1.4混匀器.4.1.5冰箱（2C~8C和-20C两种）. 4.1.6微量可调移液器（5pL.10pL 100pL，1 000pL）及配套带滤芯吸头.4.1.71.5 mL、0.5mL硅化Eppendorf 管：将Eppendorf 管和滴头浸泡于含有0.1%DEPC 的三蒸水中过夜，121C士2C高压灭菌15min，40C烘干备用.市售Eppendorf管和滴头已经硅化，可直接
GB/T 22917-2008
使用.4.1.80.2mL透明薄壁PCR管.4.1.10水浴锅：0C~100C. 4.1.96×6孔或5×8孔冰盒.4.1.11旋涡振荡器.4.2试剂4.2.1本标准所用试剂均为分析纯，试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭4.2.2三氯甲烷. 菌）分装.4.2.3异丙醇：-20C预冷.4.2.4PBS:配制方法见附录A.4.2.6裂解液：配制方法见附录A 4.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷.4.2.7酚（分析纯）.4.2.8无水乙醇（分析纯）.4.2.9AMV反转录酶（5U/uL）：-20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化.4.2.11RNA酶抑制剂（RNasin，40U/uL)：一20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化. 4. 2. 10dNTPs:含 dCTP dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmoL/L.4.2.12TagDNA聚合酶（5U/pL）：-20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化.4.2.13反转录和PCR缓冲液（5×）：配制方法见附录A.4.2.14氯化镁（25mmol/L）4.2.15引物（15μmol/L)：上游引物5-GGCAACGCATACAGCATGTT-3';下游引物5'-GCCG- TATGTCCCTTGCTTGT-3'4.2.16荧光双标记探针（10μmol/L):（FAM)5'-TATGACGGGTGGGCCAGGTT-3′(TAMRA).4.2.17DEPC处理水：按0.1%加人DEPC，摇匀.室温静置过夜.121C士2C高压灭菌20min，冷却备用，
5抽样
5.1采样工具5.1.1下列采样工具应经121C士2C，15min高压灭菌并烘干.5.1.2棉拭子. 5.1.3剪刀、镊子.5.1.4注射器.5. 1.5 1.5 mL Eppendorf 管.5.1.7真空采血管. 5.1.6研钵.5.1.8记号笔5.1.9低湿保藏箱或冰盒.5.2样品采集5.2.1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织.采集后立 即冷藏送检或置于含抗生素的PBS缓冲液中4C环境下保藏.编号并作好记录.5.2.2水泡液及水泡皮：只有当水泡完整时才能采集到水泡液，用75%酒精轻轻消毒水泡表皮，尽量去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓2
冲液灭菌瓶中.水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放入含抗生素的PBS缓冲液中.
取咽喉液体，放入加有抗生素的PBS中，编号，冷藏送检或低温保藏. 液，拭子一并放入盛有1.0mL含抗生素的PBS缓冲液的1.5mLEppendorf管中.也可用食道探杯刮
5.2.4血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中，密封、编号后保存于4C环境中送检.
5.2.5肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏.
5.3样品运
样品采集后，放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放人一个塑料袋内），于保温箱中加冰、密封，送实验室.
5.4样品制备
5.4.1水泡液、血液和口腔分泌物
样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用.
5.4.2水泡皮、肌肉或组织脏器
离心15min，取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用. 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨加10mLPBS混匀.4C下以3000r/min
5.5样本存放
制备的样本在2C～8C条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70C以下，但应避免反复冻融（冻融不超过三次）.
6操作方法
6.1实验室要求
猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区：各工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用：每一区域应有专 用的仪器设备：进人各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区.
6.2样本的处理
6.2.1在样本制备区进行.样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剖盒出售，也可自行配制.
6.2.2取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和， 编号.
6.2.3每管加人600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200uL，一份样本换用一个吸头，再加入200pL三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）.于4C以12000r/min离心15 min.
吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500pL，不能吸出中间层，颠倒混匀，
6.2.5于4C、以12000r/min离心15min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心例去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）：加入600uL75%乙醇，颠倒洗涤.
6.2.6于4C以12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）.
