中华人民共和国国家标准
GB/T22916-2008
Protocol of fluorogenic RT-PCR for vesicular stomatitis virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》（第5版）.
本标准的附录A为规范性附录：附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口.
疫局. 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检
本标准主要起草人：花群义、周晓黎、曾少灵、曹琛福、詹爱军、张彩虹、林庆燕、陈兵、杨云庆、孙洁.
水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法
1范围
本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的操作方法.本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测.
2缩略语
下列缩略语适用于本标准.
荧光反转录-聚合酶链反应.
2.2Cr值每个反应管内的荧光信号达到设定的闺值时所经历的循环数.
2.3 RNA核糖核酸.
2.4 DEPC 焦碳酸磷酯.
2.5 PBS磷酸盐缓冲盐水（配方见附录A）.
2.6Taq酶 Taq DNA聚合酶.
2.7VSV水泡性口炎病毒.
3原理
水泡性口炎病毒属RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针.通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针.探针的5编标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团：3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告 荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团.在扩增时，Taq酵发挥它的5'→3'编外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，标记在探针两编的报告荧光基团和淳灭荧光基团均游离于溶液中，仪器检测到发出的荧光信号.
4材科与试剂
4.1.1荧光RT-PCR检测仪.4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）.4.1.3台式离心机（离心速度3000r/min）.4.1.4混匀器. 4.1.5冰箱（2C~8C和-20C两种）.4.1.6微量可调移液器（5pL 10pL 100pL，1000gL）及配套带滤芯吸头.
GB/T 22916-2008
4. 1. 7Eppendorf 管（1. 5 mL)、透明薄壁PCR管（0.2 mL).4.2试剂4.2.1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC 水处理后高压灭菌）分装.4.2.2三氯甲烷.4.2.3异丙醇：-20C预冷.4.2.4PBS，配方见附录A.4.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷. 4.2.6水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项参见附录B.4.2.7引物：上游引物为5'-ATGGCTCCTACAGTTAAGAGAATCA-3'，下游引物为5'-TGAAG-TAATCAGCCGGGTATTC-3'4.2.8荧光双标记探针（10μmol/L):（FAM)5'-CGAAATTACCGGCCA ACGAGGATC-3'（TAM-AR）.扩增目标片段长度为97bp.
5抽样
5.1.1下列采样工具应经121C士2C，15min高压灭菌并烘干. 5.1.2棉拭子.5.1.3剪刀、镊子.5.1.4注射器.5.1.6研体 5. 1. 5 1. 5 mL Eppendorf 管 .
5.2样品采集5.2.1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织.采集后立即冷藏送检或放人含抗生素的PBS缓冲液中于4C环境中保藏.编号并作好记录.5.2.2水泡液及水泡皮：只有当水泡完整时才能采集到水泡液，水泡一且出现很快就会破溃，所以要不失时机地采集水泡液.首先用75%酒精轻轻消毒水泡表皮，尽量去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒 精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中.5.2.3水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放人含抗生素的PBS缓冲液中.若水泡已经破溃，则只能采集破溃的水泡皮，用灭菌生理盐水潮洗掉水泡皮上的污物，放入上述缓冲液中.5.2.4口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮3次～5次取分泌 液，拭子一并放入盛有1.0mL含抗生素的PBS缓冲液的1.5mLEppendorf管中.也可用食道探杯刮取咽喉液体，放入加有抗生素的PBS中，编号，冷藏送检或低温保藏.5.2.5血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中，密封、编号后保存于4C环境中送检.
温保藏.
5.3样品贮运
样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放人一个塑料袋内），于保温箱中加冰、密封，送实验室.
5.4样品制备
5.4.1水泡液、口腔分泌物、血液和精液
样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转2
人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用.
5.4.2水泡皮、肌肉或组织脏器
离心15min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用.
5.5样本存放
复冻融（冻融不超过三次）.
6操作方法
6.1实验室要求
水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区；各工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；每一区域应有专用的仪器设备：进人各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区.
6.2样本的处理
6.2.1在样本制备区进行.样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制.
6.2.2取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），编号.
6.2.3每管加入600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200uL，一份样本换用一个吸头，再加入200pL三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）.于4C以12000r/min离心15min.
6.2.4取与6.2.2相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加人500gL异丙醇（-20C预冷），做标记. 吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500pL，不能吸出中间层，颠倒混匀.
6.2.5于4C、以12 000r/min离心15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）：加入600L75%乙醇，颠倒洗涤.
6.2.6于4C、以12 000r/min离心10min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒 去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）.
6.2.7以4 000r/min离心10 s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶.
6.2.8各管加人11μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2000r/min离心5s，冰上保存备用.提取的RNA应在2h内进行PCR扩增：若需长期保存应放置于-70C冰箱内.
6.3检测
6.3.1扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行.从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Tag酶，在室温下融化后，以2000r/min离心5s.设所需荧光RT-PCR检测总数为n（n=#21），其中为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数，每个样品测试反应体系配制见表1.
