中华人民共和国国家标准
GB/T22943-2008
Determination of trimethoprim residues in honeyLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：曹彦忠、贾光群、杨志伟、石玉秋、孙海侠、庞国芳.
蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了蜂密中三甲氧苄氨密啶残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.本标准适用于蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定. 本标准的方法检出限为2.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1:1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，1SO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3原理
的固相萃取柱净化.用甲醇洗脱并蒸干，残渣用流动相溶解，过0.2μm滤膜后，样品溶液供液相色谱-串 蜂蜜中残留的三甲氧苄氨嘧啶用磷酸盐缓冲溶液（pH=9）提取，过滤后，经OasisHLB"柱或相当联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
4.1水：GB/T6682，-级. 4.2甲醇：色谱纯.4.3乙晴：色谱纯.4.4磷酸氢二钾（KHPO3HO）：优级纯.4.6氢氧化钠：优级纯. 4.5磷酸二氢钾：优级纯.4.7甲酸：优级纯.4.82.0mol/L氢氧化钠：称取8.0g氢氧化钠（4.6），定容至100ml.4.90.1%甲酸溶液：吸取1.0mL甲酸（4.7）.用水稀释至1000mL.4.110.2mol/L磷酸盐缓冲溶液：称取43.86g磷酸氢二钾（4.4）和1.05g磷酸二氢钾（4.5），放人 4.10淋洗液：甲醇溶液（23）.量取40mL甲醇（4.2）与60mL水混合.1000mL烧杯中，加入800mL水溶解，用氢氧化钠（4.6）调至pH值为9.0，再用水定容至1000mL.4.12流动相：乙-0.1%甲酸溶液（713）.
1)OasisHLB国相萃取柱是Waters公司产品的商品名称给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.
GB/T 22943-2008
4.13标准物质：三甲氧苄氨嘧啶（CAS：738-70-5），纯度≥99%4.140.1mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的三甲氧苄氨嘧啶标准物质（4.13），用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备溶液，标准储备溶液在4C保存.4.15标准工作溶液：吸取标准储备溶液（4.14）0.1mL移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度.该 溶液在4C保存.4.16基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液（4.15），用空白样品提取液配成2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0 ng/mL、20.0ng/mL、50 Ong/mL不同浓度的基质标准工作溶液.当天配制.4.17OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL.使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，4.18滤膜：0.2um 保持柱体湿润.
5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3氮气浓缩仪. 5.4液体混匀器.5.5固相萃取装置.5.6贮液器：50mL.5.7真空泵：真空度应达到80kPa.5.9吹干管：10mL. 5.8pH计.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
对无结品的实验室样品，将其搅拌均匀.对有结品的样品，在密闭情况下，置于不超过60C的水浴中，密封，并做上标记. 中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温.分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶
6.2试样保存
将试样于常温下保存.
7测定步骤
7.1提取
称取2g试样，精确至0.01g.置于150mL三角瓶中，加人25mL磷酸盐缓冲溶液（4.11)，于液体混匀器（5.4）上快速混匀1min，使试样完全溶解.
7.2净化
将塞有玻璃棉的玻璃贮液器（5.6）连到OasisHLB固相萃取柱（4.17）上，把样液倒人玻璃贮液器中，调节流速小于3mL/min，使样液通过OasisHLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5mL水10mL吹干管中.用氮气浓缩仪于50C吹干.准确加人1.0mL流动相（4.12）溶解残渣，过0.2gm 和5mL淋洗液（4.10）洗柱，弃去全部流出液.减压抽干20min，然后用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于滤膜后，供液相色谱-中联质谱仪测定.
按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液.
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：AtlantisC、3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者： b）流动相：乙-0.1%甲酸溶液（713）；c）流速：0.2mL/min;d）柱温：30C；e）进样量：20pl.
7.3.2质谱参考条件
b）扫描方式：正离子扫描； a) 离子源：电喷雾离子源；c）检测方式：多反应监测；d) 电喷雾电压：5500V；e) 雾化气压力：0.076MPa；g）辅助气流速：6L/min; f) 气帘气压力：0.069MPa；h）离子源温度：450C；i）定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1.
表1定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去电压
化合物中文名称 化合物英文名称定性离子对（m/=1定量高子对（m/=） 碰撞气能量/V 去额电压/V三甲氧苄氨嘧啶 trimethoprim 291/230 291/123 291/230 35 40 50291/275 35
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性测定
标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内：且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标 被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物.
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以为表示
相对离子丰度K K>50 20<K<50 10<K<20 K≤10允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.2定量测定 准工作曲线.用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨嘧啶的响应值均应在仪器测定 用标准工作溶液（4.16）分别进样，以标准峰面积为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标的线性范围内.在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧苄氨嘧啶的参考保留时间为2.39min.三甲氧苄氨嘧啶的标准物质多反应监测（MRM）色谱图参见附录A中的图A.1. 本方法的添加平均回收率数据参见附录B中的表B1. 7.5平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定. 7.6空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行.
