中华人民共和国国家标准
GB/T22949-2008
蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination nitroimidazoleresidues in royal jellyand lyophilizedroyal jelly farinaLC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.
本标准主要起草人：股居易、刘永明、谢东华、陈杰、李金、章再婷、范春林、裘定慧、庞国芳.
蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了蜂王浆及冻干粉中甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、洛硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑，以及羟基化甲硝唑、羟基化异丙硝唑、2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑等9种硝基咪唑类药物残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于蜂产品（蜂王篆、冻干粉及蜂蜜）中硝基咪唑类药物残留量的测定.
本标准蜂王浆样品的方法检出限；0.5μg/kg
本标准冻干粉样品的方法检出限：1.0pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
2004 ISO 5725-1; 1994 IDT) GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
本方法用乙酸钠缓冲液溶解样品基质，乙酸乙酯进行液-液萃取，经过旋转蒸干后，加人四氯化碳和含酸水溶液，离心后取上层溶液，运用液相色谱中联三重四极杆质谱仪（LC-MS-MS）进样检测.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.7标准品：甲硝唑（metronidazole，缩写MNZ;CAS：443-48-1），地美硝唑（dimetridazole，缩写DMZ；CAS：551-92-8)，替硝唑（tindazole 缩写TNZ;CAS：19387-91-8)，洛硝唑（ronidazole，缩写RNZ;CAS：7681-76-7）.特尼唑（ternidazole，缩写TerNDZ），异丙硝唑（ipronidazole，缩写IPZ），羟基化甲硝咪唑 （metronidazole-OH，缩写MNZ-OH），羟基化异丙硝唑（ipronidazole-OH缩写1PZ-OH）2-羟甲基-1-甲基化-5-硝味唑（2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-imidazole，缩写HMMNI），以上标准物质纯度
≥98%.内标物为气代2-羟甲基-1-甲基化-5-硝味唑（HMMN1-D：CAS：8061-52-7），代羟基化异丙硝唑（1PZ-OH-ID:CAS：8061-52-7).尔代物质纯度≥95%.4.8标准储备溶液：1000μg/mL.准确称取10.0mg士0.05mg各标准物质，用甲醇溶解于10mL棕液.将储备液置于一20C冰箱中保存备用.4.9标准中间溶液：100ng/ml.可将标准储备溶液（4.8）室温下放置5min，使用时用乙稀释至所需浓度，临用临配.4.10乙酸钠缓冲溶液：0.1mol/L.准确称取8.204g无水乙酸钠，加入5.83mL冰乙酸定容到 1000mL容量瓶中，超声混合并脱气15min后，于液相色谱流动相瓶中备用.4.11甲酸水溶液：0.1%.准确移取1mL甲酸，用水定容到1000mL容量瓶中，超声混合并脱气15min后，于液相色谱流动相瓶中备用.4.12基质混合标准工作液：根据标准物质的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的中间浓度混合标准4.13滤膜：0.2ym. 液（4.9），用空白样品提取液配制成系列浓度的基质混合标准工作液.临用临配.
5仪器
5.1液相色谱-中联三重四极杆质谱仪（LC-MS-MS）：质谱仪配有大气压化学电离源（或与之等效电离 源）：高效液相色谱配有在线脱气机、低残留自动进样器、可控温柱温箱和高精度混合系.5.2电子分析天平：感量0.1mg和10mg.5.3冷冻离心机：递度可达4 000r/min和13000r/min.5.4氮吹仪：水浴和加热控温.5.5台式分散仪. 5.6旋转浓缩仪：带真空蒸发和循环冷却水.5.7超纯水器.5.8超声波清洗器.5.9多功能食品粉碎机，5.10旋涡混合仪. 5.11鸡心瓶：125mL.5.12离心管：15mL和50mL；聚四氟乙烯材质.5.13容量瓶：10 mL和1 000mL.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将液体、浆状、粉状的样品充分混合均匀：将低湿保存的固体样品进行粉碎磨细后供检测.必要时将实验室样品用四分法进行缩分.根据样品的性状和保存要求将样品保存在适当的环境中避免变质.
6.2试样的保存
将试样于一20C冰箱中保存备用.
7测定步骤
7.1提取
称取约2.5g~5.0g试样（蜂王浆称量5.0g±0.2g；冻干粉称量2.5g±0.2g）于50mL离心管中，分别添加氟代标示物HMMN1-D²、IPZ-OH-D²（4.7)100μL 加人20mL乙酸钠缓冲溶液（4.10）充2
分涡旋振荡提取1min.
再加人20mL乙酸乙酯，经过涡旋、液-液萃取，将乙酸乙酯层全部移入鸡心旋蒸瓶，重复上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于鸡心旋蒸瓶，在40C以下浓缩近干，除去溶剂.
7.2净化
鸡心旋蒸瓶残渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液（4.11）溶解，充分涡旋1min.吸取上层水溶液，用微孔过滤膜（0.2μm）过滤，此为试验溶液.
7.3色谱测定
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Waters Sunfire ODSC，5μm250 mmX4.6mm（内径）或相当者：b）柱温：30C；c) 流动相：0.1%甲酸水溶液：液相梯度见表1；e）进样量：10p. d) 流速：800μL/min；
表1液相色谱流动相梯度表
时间/min 流动相A（甲酸水溶液）/% 流动相B(乙晴溶液1/% 流速/(μL/min)0.00 95 5 8002 00 56 5 8006 00 65 35 80012 00 10 90 80014 00 10 90 80015 00 95 5 80020 00 95 5 800
7.3.2质谱参考条件
b）扫描方式：正离子扫描； a) 离子源：大气压化学电离源（或与之等效电离源）；c) 检测方式：多反应离子监测（MRM）：d) 电喷雾电压（1S）：5250V；e) 雾化气（NEB）相对开放流量：14.00mL/min； 气帘气（CUR）相对开放流量：7.00mL/min；f) g) 离子源温度（TEM）：500C；碰撞池出口电压（CXP）：11V；i) 选择离子驻留时间（Dwell）：50ms；k）碰撞气（CAD）相对开放流量：8mL/min； j) 撞池入口电压（EP）：10.0V：[) 辅助气流压力：413.8kPa；m）去簇电压（DP）:35V：n）焦环聚焦电压（FP）：200V；p）检测器参数（正离子化模式），离子流转向电压（DF）：-200.0V：检测器脉冲信号增强电压 o）喷雾器放电针电流（NC）：2μA；(CEM) :2 300. 0 V ;q）定性离子对、定量离子对、碰撞气能量、色谱峰保留时间见表2.
