中华人民共和国国家标准
GB/T22965-2008
牛奶和奶粉中12种β-兴奋剂 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of 12 β-agonists residues in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.本标准主要起草人：杨方、刘正才、林永辉、余孔捷、黄杰、李罐平、陈健、庞国芳.
牛奶和奶粉中12种β-兴奋剂 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中12种3-兴奋剂残留量的液相色谱-中联质谱的测定方法.
本标准适用于牛奶和奶粉中12种B兴奋剂多残留的测定.12种-兴奋剂药物包括溴布特罗（brombuterol）、塞曼特罗（cimaterol）、克仑特罗（clenbuterol）、克仑潘特（clenpenterol）、羟甲基氨克仑 特罗（hydroxymethylelenbuterol）、苯氧丙酚胺（isoxsuprine）、马布特罗（mabuterol）、莱克多巴胺（ractopamin）、利托君（ritodrine）、沙丁胺醇（salbutamol）、特布他林（terbutaline）和妥布特罗(tulobuterol) .
本标准的的方法检出限：牛奶中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的检出限为0.05ug/kg，溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的检出 限为0.25μg/kg：奶粉中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的检出限为0.4pg/kg，溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的检出限为 2.0 yug/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
(GB/T 6379 1-2004 1SO 5725-1;1994 IDT) GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，M0D）
3原理
样品经稀酸水解、高氯酸沉淀蛋白后，残留的3-兴奋剂以乙酸乙酯与异丙醇混合溶剂萃取，混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱净化，液相色谱-中联质谱测定，内标法定量.
4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2异丙醇.4.3乙酸乙酯. 4.4乙晴：色谱纯.4.5甲酸.4.6高氯酸.
4.7盐酸.4.8氢氧化钠.4.9乙酸铵：色谱纯. 4.10氨水.4.11氯化钠.4.1210mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠至100mL水中，混匀4.130.1mol/L高氯酸溶液：移取0.4mL高氯酸至100mL水中，混匀.4.155mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵至约800mL水中，加人2mL甲酸，定容至 4.140.1mol/L盐酸溶液：移取0.85mL盐酸至100mL水中，混匀.1000mL，混匀.4.16甲醇-0.1%甲酸溶液：移取0.1mL甲酸于约50mL水中，加人10mL甲醇，以水定容100ml，混匀，4.17标准物质：澳布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、 莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，纯度大于98.0%.4.18内标标准物质：盐酸克仑特罗-D9、盐酸莱克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3，纯度大于98.0%.4.19标准储备液（100μg/mL）：准确称取适量的浪布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备液，-20C冰箱中保存.4.20混合标准储备液（1μg/mL）：分别准确量取1.0mL的标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇 稀释至刻度，一20C冰箱中保存.4.21内标储备液（100μg/mL）：准确称取适量的克仑特罗-D9、莱克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3对照品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液，一20C冰箱中保存.4.22内标工作液（10ng/mL）：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲醇稀释4.23基质标准工作溶液：以空白基质溶液将混合标准储备液与内标工作液稀释至适当浓度，临用 定容成浓度为10ng/mL的同位素内标工作液，一20C下冰箱中保存.现配.4.24混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱：60mg/3mL，使用前依次用3mL甲醇和3mL水活4.25滤膜：0.2um. 化，保持柱体湿润.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-中联质谱仪：配电喷雾电离（ESI）源.5.2天平：感量0.1mg和0.01g.5.4高速冷冻离心机：转速可达15000r/min，制冷可达4C. 5.3组织捣碎机.5.5离心机：5 000 r/min.5.6旋涡振荡器.5.7电热恒温振荡水槽.5.8pH计. 5.9旋转蒸发仪.5.10固相萃取装置.5.11氮吹仪.2
6试样制备和保存
6.1试样制备
取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记.
6.2试样保存
牛奶置于4C冰柜中避光保存，奶粉则在室温下置于干燥器保存.
7测定步骤
7.1提取
7.1.1牛奶
物，加人20mL0.1mol/L盐酸溶液（4.14），误旋混匀，于37C下避光水浴振荡16h（过夜），取出冷却 准确称取10g（精确到0.01g）牛奶样品于50mL聚丙烯离心管内，加人50pl 10ng/mL的内标至室温，涡旋混匀，4C下15000r/min离心10min，分取10mL上清液转移至另一50mL离心管内.加人5mL0.1mol/L高氯酸溶液（4.13），用10mol/L氢氧化钠溶液（4.12）调节pH值至9.7±0.3，加人约2g氯化钠，再加入25mL异丙醇-乙酸乙酯（32），涡动提取2min，4500r/min离心5min，取出 上清液至另-50mL离心管中.再在下层水相中加15mL乙酸乙酯-异丙醇（73），涡动提取1min，4 500r/min离心5min，合并有机相，40C下旋转蒸发至近干，加入5mL0.1mol/L盐酸溶液（4.14），涡动1min.待净化.
7.1.2奶粉
取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35C~50C水将其溶解，待冷却至室湿后，加水至总质量为100g，充分混匀后准确称取10g（精确到0.01g）样品于50mL聚丙烯离心管中，按7.1.1步骤进行处理.
7.2净化
将7.1所得溶液以约1mL/min的流速全部过混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱（4.24）.依次用3mL水、3mL2%甲酸水溶液和2mL甲醇淋洗，抽干，用5mL5%氨水甲醇溶液（体积分数）洗脱，洗脱液于40C下以氮气吹至近干，以0.5mL甲醇-0.1%甲酸溶液（19）溶解，涡动混匀，过0.2μm滤膜（4.25）.供液相色谱-串联质谱仪测定.
7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品10g（精确至0.01g），按7.1和7.2步骤操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Acquity UPLC BEHC，1.7μm，2.1 mm×55 mm（内径）或相当者；b）流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液（4.15），B为0.1%甲酸乙晴（体积分数），梯度洗脱，洗脱程序见表1：
表1梯度洗脱程序
时间/min A/% B/%0 00 85 151.0 2. 0 85 30 15 702.5 30 703 0 85 155 0 85 15
