中华人民共和国国家标准
GB/T 22967-2008
牛奶和奶粉中β-雌二醇残留量的测定 气相色谱-负化学电离质谱法
Determination of β-estradiol residues in milk and milk powderGas chromatography-negative-ion chemical ionizationmass spectrometry method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：王建华、张艺兵、郭翠、王境堂、孙忠松、庞国芳.
牛奶和奶粉中β-雌二醇残留量的测定 气相色谱-负化学电离质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中B雌二醇残留量气相色谱-负化学电离质谱测定方法.本标准适用于牛奶和奶粉中雌二醇残留量的测定.本标准的方法检出限：牛奶0.25μg/kg，奶粉2μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1: 1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
牛奶和奶粉中雌二醇经过酵水解，用乙晴作为蛋白沉淀剂和提取剂进行提取，固相萃取柱净化后，经酰化衍生化后，用气相色谱-负化学电离质谱选择离子监测模式测定，内标法定量，
4试剂和材料
4.1β-葡糖苷酸酵/芳基硫酸苷酶：Helixpomatia，每毫升含β-葡糖苷酸酵100000单位，每毫升硫酸 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.酯酶≤1000单位.4.2甲醇：色谱纯.4.3乙睛：色谱纯.4.5正已烷：色谱纯， 4.4乙酸乙酯：色谱纯.4.6吡啶：色谱纯.4.7异辛烷：色谱纯.4.8正丙醇：分析纯.4.9衍生化试剂：五氟苯甲酰氯，在避光、防潮环境冷冻储藏.4.10碳酸氢钠. 4.11三水乙酸钠.4.12氯化钠4.130.1%乙酸溶液：移取0.1mL冰乙酸，用水定容100ml.
GB/T 22967-2008
4.14乙酸钠缓冲液（pH=5.2）：称取43g三水乙酸钠（4.11）用水溶解，加入25.2g冰乙酸用水定容至1 000 mL 4.15干燥乙酸乙酯：在密封试管中加人500mg无水硫酸钠和20ml.乙酸乙酯，振荡混合约30min 后，2 000 r/min 离心 10 min.4.16乙酸乙酯-哦啶（91)：将10mL吡啶和90mL干燥的乙酸乙酯（4.15）混合，室温保存.4.170.5mol/L碳酸氢钠（NaHCO ）溶液：称5gNaHCO，于100mL容量瓶中，用水定容至刻度.4.18Oasis HLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL.使用前分别依次用6mL甲醇，3mL0.1%乙酸溶液和3mL纯水活化保持柱体湿润. 4.19标准物质：雌二醇，纯度≥99%4.20内标标准物质：β-雌二醇-2.4，16，16-4氛代（β-雌二醇D4)，纯度≥99%.4.21β-雌二醇标准溶液：准确称量10mg标准物质（4.19）分别于100mL容量瓶中，用甲醇（4.2）定容至刻度，浓度100ug/mL，储备液储存于一20C.再以甲醇稀释成适用浓度的溶液，保存于4C冰4.22内标标准溶液：准确称量10mg内标标准物质（4.20）分别于100ml容量瓶中，用甲醇（4.2）定 箱中.容至刻度，浓度100pg/mL，储备液储存于一20C.再以甲醇稀释成适用浓度的溶液，保存于4C冰箱中.步骤衍生化后备用.
5仪器
5.1气相色谱-质谱仪：配有负化学源.5.2离心管：5mL和10mL，具塞.5.3移液器:20 μL~200 μrL200 μL~1 000 μL，1 000 pL~5 000 μL. 5.4分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.5冷冻离心机：最低温度一4C，最大转速10000r/min.5.6涡旋混匀器.5.7氮气浓缩仪.5.8水平振荡器. 5.9旋转蒸发仪.5.10旋涡振荡器.
6.1.1牛奶：取有代表性试样约500g.搅拌均匀后装入洁净容器内，密封，并微好标识.6.1.2奶粉：取有代表性试样约500g.搅拌均匀后装人洁净容器内，密封，并做好标识.准确称取12g冷却至室温后，移人100mL容量瓶中，用少量水分次潜洗烧杯，淋洗液一并移人容量瓶，再用水定容到 刻度，混匀，制备成奶粉复原乳试样.
6.2试样的保存
将试样于4C保存.
1）Oasis HLB国相萃取柱是Waters公司产品的商品名称给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.
7测定步骤
7.1提取
准确移取2.0g牛奶或量取2.0mL奶粉复原乳试样（6.1.2）置于50mL具塞离心管中.加入5mL乙酸钠缓冲溶液（4.14）、约1g氯化钠（4.12），旋涡振荡1min后，加入10mL乙睛（4.3），充分旋涡混合1min，于水平振荡器上（5.8）剧烈振荡2min，超声提取10min，7 00r/min于4C离心10min，用吸管将上清液移人另一离心管.残渣中加入10mL乙晴，按上述方法再提取一次，合并上清液.
上清液中加人10mL正已烷（4.5），剧烈振荡2min，7 000x/min于4C离心5min，吸正已烷，弃去下层溶液转移至梨形瓶，加人0.5mL正丙醇（4.8）于40C水浴旋转蒸发（约剩余1mL左右不能完全蒸干）.加人1mL乙睛，旋涡振荡1min.转移至10mL离心管，再用1mL乙睛清洗瓶一次，溶液转移至上述离心管后，用纯水定容到10mL.
7.2净化
将提取液（7.1）移入下接OasisHLB柱（4.18）的贮液器中.溶液以不大于1mL/min的流速通过OasisHLB柱，待溶液完全流出后，用3mL纯水洗柱，弃去全部淋出液，抽干.最后用9mL乙晴洗脱，收集洗脱液于10mL具塞离心管（5.2）中，用氮气浓缩仪（5.7）吹干.
7.3衍生化
在上述10mL具塞离心管中依次加人85L干燥的乙酸乙酯（4.15），500μL乙酸乙酯-吡啶（4.16），20μL五氟苯甲酰氯（4.9），混匀，于60C放置15min后，用氮气浓缩仅吹干.加人500μL0.5mol/1碳酸氢钠溶液（4.17），误旋振荡.待溶液澄清后，准确加人1mL异辛烷，混合提取，静置，取上清液进行测定.
7.4测定条件
7.4.1气相色谱-质谱测定参考条件
a）色谱柱：HP-5MS.0.25gm30mX0.25mm（内径）或相当者：b）载气：氮气，纯度≥99.999%： c）流速：初始流速1.0mL/min，保持5min，然后以1.0mL/min速度升至3mL/min;d）柱温：120C保持2min，然后以15C/min升温至250C，再以5C/min升温至300C保持tuu gf）进样方式：无分流进样： e）进样量：1gL;g）进样口温度：300C；h）接口温度：280C；i）负化学源：150eV； j）离子源温度：150C；k）四极杆温度：106C；1）反应气：甲烷，纯度≥99.99%；m）反应气流量：2mL/min；n）选择离子监测：监测离子、丰度比、允许相对偏差见表1.
表1监测离子、丰度比、允许相对偏差
监测离子（m/=) 丰度比/% 允许相对偏差/%660 100661 40 ±25448 80 ±20450 44 ±25
