中华人民共和国国家标准
GB/T22982-2008
牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、 二甲硝唑及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination ofmetronidazole，ronidazole.dimetridazole residuesin milk and milk powderLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.
本标准主要起草人：王风池、艾连峰、郭春海、段文仲、陈瑞春、吕红英、窦彩云、马育松、庞国芳.
二甲硝唑及其代谢物残留量的测定 牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的高效液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的测定和确证.
本标准的方法检出限：牛奶中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑为0.5μg/kg，羟基甲硝唑为1μg/kg1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑为2.5μg/kg：奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑为2.5μg/kg，羟基甲硝唑为5μg/kg.1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑为12.5μg/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
2004 ISO 5725-1:1994 IDT) GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004.ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696:1987，MOD)
3原理
标法定量. 用乙睛-乙酸乙酯提取试样中的分析物，阳离子固相萃取柱净化高效液相色谱-串联质谱测定内
4试荆和材料
除另有说明外，所用试剂均为液相色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.2乙酸乙酯. 4.1乙脂.4.3甲醇.4.4丙酮4.5乙酸. 4.6氨水.4.7无水硫酸钠，分析纯：经650C灼烧4h，置于干燥器内备用.4.8氨水-乙睛（119）：量取5mL氨水，用乙晴定容至100mL.4.9标准品：甲硝唑（metronidazole CAS：13182-89-3）、洛硝哒唑（ronidazole，CAS：7681-76-7）、二甲基-5-硝基咪唑（hydroxydimetridazole，CAS：936-05-0）、尔代洛硝唑（RNZ-D3）、氛代羟基甲硝唑 硝唑（dimetridazole，CAS：551-92-8）、羟基甲硝唑（metronidazole-OH，CAS：7681-76-7）、1-甲基-2-羟甲
（MZNOH-D2）和氛代1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑（HMMN1-D3）：纯度均大于等于98%.
GB/T 22982-2008
4.10标准储备液：分别精确称取适量标准品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液.4.11混合标准中间工作液：取标准储备液各1mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混4.12内标标准储备溶液：称取适量尔代内标标准品，用甲醇溶解成浓度为200ug/mL储备液. 合标准工作液，浓度为1ug/mL.4.13内标混合标准中间工作液：量取适量标准储备液（4.12），用甲醇定配制成内标混合标准中间工作液，浓度为1μg/mL.4.14滤膜；0.45 μm.4.15阳离子固相萃取柱：500mg，3mL，使用前依次用3mL甲醇、3mL乙酸乙酯活化.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.3分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.2离心机.5.4旋涡混和器.5.5旋转蒸发仪.5.6氮吹仪.5.7固相萃取装置.
6试样的制备与保存
6.1牛奶
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4C下保存，并标明标记.
6.2奶粉
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记.
7测定步骤
7.1提取
人5mL水.往称取好的样品中加人25yL100ng/mL内标混合液，混匀. 牛奶样品称取5g（准确至0.01g）于50mL具塞离心管中，奶粉样品称取1g（准确至0.01g）并加
在称取好样品离心管中首先加人5mL乙以沉淀蛋白，然后再加人20mL乙酸乙酯，振荡提取2 min后，3 000r/min离心10min，移取上清液并通过5g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中.再用20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中.
7.2净化
将提取液于45C下旋转蒸发至约2mL左右，然后转移到已活化的固相萃取柱上，再用5mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到固相萃取柱上，以小于2mL/min流速滴下.接着依次用3mL丙酮，3mL甲醇，2mL氨水-乙晴（595）淋洗，最后用5mL氨水-乙晴（595）洗脱并收集（此过程流0.45μm 滤膜供 HPLC-MS-MS 分析. 速小于2mL/min）.洗脱液在45C水浴上用氮气小心吹至近干，用水定容至1mL，涡滋混合后，过
7.3空白基质溶液的制备
将取牛奶阴性样品5g，奶粉阴性样品1g（精确到0.01g），按7.1和7.2操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：Cs-5pm.150mm×2.1mm（内径）或相当者：
b）色谱柱温度：30C；c）进样量：15μL:d）流动相梯度及流速见表1.
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间/min 流速/(μL/min) 0 1%乙酸水溶液/% 乙脂/%0 00 200 80 206 00 00 65 358 00 007 65 358 10 200 80 2010.0 200 0 20
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子化模式：电喷雾正离子模式（ES1）；b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；c) 气压力：104kPa；d) 辅助气压力：138kPa；e) 正离子模式电喷雾电压（IS）：4000V； 毛细管温度：320C；f) 源内诱导解离电压：10V；Q1为0.4.Q3为0.7；i 碰撞气：高纯氢气；j）碰撞气压力：0.2 Pa； k）参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表2.
表2被测物的参考保留时间、监测离子对和裂解能量
化合物名称 保留时间/min 检测离子对（m/≥) 裂解能量/eV188 04/122 96 13羟基甲硝唑 3 74 188 04/125 94 181-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑 4 82 158 06/140 01* 12158 06/112 05 19甲硝唑 4 79 172 09/128 00* 15172 09/82 03 25洛硝哒唑 5 76 201 05/139 98* 201 051/110 0 12 17142 07/96 03° 16二甲硝唑 6 43 142 07/81. 03 29氛代经基甲硝哒唑 3 74 190 05/124 97 12氛代1-甲基-2-羟甲基-5-确基味唑 4.82 161 06/143. 00 13氧代洛硝哒唑 4 79 204 04/143 00 11为定量离子对，对于不同质谱仪器，仅器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最住.
