中华人民共和国国家标准
GB/T22984-2008
牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of the residues of metabolites of carbadox andolaquindox in milk and milk powderLC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：林黎、谢丽琪、欧阳姆、梁宏、叶刚、廖菁菁、庞国芳、
液相色谱-串联质谱法 残留量的测定
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹晒啉-2-孩酸（quinoxaline-2-carboxylicacid）和唑乙醇代谢物3-甲基喹哪-2-孩酸（3-methylquinoxaline-2-carboxylicacid>残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.
代谢物3-甲基唑琳-2-酸（3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid）残留量的测定.
本标准的方法检出限：唑啉-2-羧酸和3-甲基喹恶啉-2-羧酸的方法检出限牛奶为0.5μg/kg，奶粉为 4. 0 μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987 MOD）
3原理
用甲酸溶液消化试样，使牛奶和奶粉中天然存在的酶失活，然后加人蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，固相萃取柱净化，液相色谱-中联质谱仪测定，内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2甲酸：色谱纯.4.3乙酸钠 4.4乙酸乙酯.4.52%甲酸-乙酸乙酯溶液：向400mL乙酸乙酯中加人10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL.4.60.6%甲酸溶液：量取6.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L.4.70.1%甲酸溶液：量取1.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L.4.90.1mol/L盐酸溶液：量取8.3mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L. 4.8甲酸-甲醇溶液（191）：用190mL甲酸溶液（4.2）与10mL甲醇（4.1）混合.4.100.3mol/L盐酸溶液：量取25mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L.
4.11Protease蛋白酶：SigmaP5147或相当者，-18C以下保存.4.120.01 g/mL 蛋白酶水溶液：称取1.00 gProtease蛋白酶（4.11)，用水溶解、定容至100mL 4C4.1310%乙酸溶液：量取100mL乙酸，用水溶解、定容至1L. 保存.4.140.05mol/L乙酸钠溶液：称取6.8g乙酸钠用800mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液以调节溶液pH=7，用水定容至1L.4.15乙酸钠-甲醇溶液（191）：用190mL乙酸钠溶液（4.14）与10mL甲醇（4.1）混合.4.16甲醇-水溶液（14）.4.17Tris 碱：SigmaT1503或相当者. 4.181.0mol/LTris溶液：称取121gTris 碱（4.17），用水溶解、定容至1 L，4C保存.4.19喹啉-2-羧酸、3-甲基喹晒咻-2-羧酸、喹啉-2-羧酸-d4标准物质：纯度≥99%.4.20标准储备液：100mg/L.准确称取适量标准物质，分别用甲醇溶娜定容，配成100mg/L的标准储备液，在一18C以下保存.4.21基质混合标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓度（pμg/L）的混4.22内标工作溶液：准确称取适量喹嗯啉-2-羧酸-d4标准物质，用甲醇溶解定容，配成100pg/L的标 合标准工作溶液，在4C保存.准工作溶液，在4C保存.4.23OasisMAX固相萃取柱或相当者：60mg，3mL.用前分别用3mL甲醇和3mL水活化，保持4.24滤膜：0.2 yum. 柱体湿润.
5仪器和设备
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2固相萃取真空装置.5.3吹氮浓缩仪. 5.4旋涡振荡器.5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.6真空系.5.7低温离心机：可制冷到4C，转速大于5000r/min.5.8移液器量程：10gL~100pl和100μL~1 000μL. 5.9聚丙烯离心管：15mL和50mL，具塞.5.10pH计：精度士0.02pH单位.
6试样制备与保存
6.1试样的制备
取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并作上标记.
牛奶置于4C冰柜中避光保存，奶粉则于室温下置于干燥器保存.
7测定步骤
7.1提取
7.1.1牛奶
准确称取5g牛奶样品（精确到0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，加入一定量的内标溶液（4.22），使其浓度为2.0ng/g.再加人10mL0.6%甲酸溶液（4.6），混匀后，置于（47土3）C振荡水浴混匀后，置于（47±3）C振荡水裕中酶解16 h~18h.加人20mL0.3mol/L盐酸（4.10），振荡5 min， 中振摇1h；然后先加入3mL1.0mol/LTris溶液（4.18），再加入0.3mL蛋白酶水溶液（4.12），充分在10C以5000r/min离心15min，上清液过滤.
7.1.2奶粉
取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35C~50C水将其溶解，待冷却至室温后.加水至总质量为100g，充分混匀后准确称取5g样品（精确到0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，按7.1.1步骤进行 处理.
7.2净化
将7.1所得溶液以约1mL/min的流速全部通过Oasis MAX固相萃取柱（4.23），分别用15mL乙酸钠-甲醇溶液（4.15）淋洗固相萃取柱，真空抽干15min.再用5mL甲醇、3mL水、5mL0.1mol/L盐酸（4.9）和3mL甲醇-水溶液（4.16）分别淋洗，真空抽干15min，然后用2mL乙酸乙酯淋洗固相萃 取柱，弃去全部淋出液，最后用3mL甲酸-乙酸乙酯溶液（4.5）洗脱喹啉-2-羧酸和3-甲基唑啉-2-酸，置于15mL聚丙烯离心管中，在45C用氮气浓缩仪吹干.准确加人1.0mL甲酸-甲醇溶液（4.8）溶解残渣，过0.2um滤膜，供液相色谱-中联质谱仪测定.
7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确到0.01g），按7.1和7.2步骤操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：ODS.3pm，100mm×2.1mm（内径）或相当者： b）流动相：甲醇、乙晴以及0.1%甲酸溶液（时间梯度见表1）；
表1流动相时间梯度
间/msin 甲醇/% 乙腊/% 0 1%甲酸/%0 0 13 7 8010 0 45 15 4010 1 64 16 2013 1 13 7 8020 0 13 7 80
d）柱温：30 C； c）流速：0.2mL/min;e）进样量：30p.
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源； b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应检测：
