中华人民共和国国家标准
GB/T22990-2008
牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法
Determination of oxytetracycline tetracycline，chlortetracycline.doxycycline residues in milk and milk powderHPLC-UVmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.本标准主要起草人：郭春海、窦彩云、陈瑞春、马育松、艾连峰、吕红英、贾海涛、姚春毅、庞国芳.
牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱-紫外检测测定方法.
本标准适用于牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定.
本标准的方法检出限：牛奶中土霉素、四环素为5pg/kg、金霉素、强力霉素为10ug/kg.奶粉中土霉素、四环素为25μg/kg、金霉素、强力霉素为50μg/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一2004 ISO 5725-1:1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696:1987 MOD)
3原理
用0.1mol/LNaEDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取试样中四环素族抗生素残留，Oasis HLB或相当的固相萃取柱和酸型阳离子交换柱净化，液相色谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙睛：色谱纯.4.3磷酸氢二钠（NaHPO12HO）4.4柠檬酸（C:HOHO）.4.5Z二胺四乙酸二钠（NaEDTA2HO). 4.6草酸（CHO2HO）.4.80.1mol/L柠檬酸溶液：称取21.04g柠檬酸（4.4）.用水溶解，定容至1000ml.4.9Mellvaine缓冲溶液：将625mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（4.7）与 1 000mL0.1 mol/L柠檬酸4.100. 1mol/L Na:EDTA-Mellvaine 缓冲溶液：称取60.50 g乙二胺四乙酸二钠（4.5）放人1 625 mL 溶液（4.8）混合，必要时用NaOH或HC1调pH=4.0±0.05Mcllvaine缓冲溶液（4.9）中，使其溶解，摇匀.
4.110.01mol/L草酸溶液：称取1.26g草酸（4.6)，用水溶解，定容至1000mL.4.12甲醇-水（119）：量取5mL甲醇（4.1）与95mL水混匀.4. 14土霉素（oxytetracycline CAS：2058-46-0)四环素（tetracyeline ，CAS;64-75-5）、金霉素（chlortet- 4.130.01mol/L草酸-乙睛溶液（11)：量取50mL草酸溶液（4.11）与50mL乙睛（4.2）混匀.racycline，CAS：64-72-2）、强力霉素（doxycyeline，CAS：24390-14-5）标准物质：纯度大于等于96%.4.150.1mg/mL土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液：准确称取适量的土霉素、因环素、金霉素、强力霉素标准物质（4.14），分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液.储备液于一20C4.16土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准工作溶液：根据需要用流动相将土霉素、四环素、金霉 保存.素、强力霉素标准储备液（4.15）稀释成所需浓度的混合标准工作溶液，储存于冰箱中，每周配制.4.17OasisHLB固相萃取柱”或相当者；500mg.6mL.使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润.4.18羧酸型阳离子交换柱：500mg.6mL.使用前用5mL甲醇预处理.保持柱体湿润.
5仪器
5.1液相色谱仪：配有紫外检测器.5.2分析天平：感量0.1mg，0.01g. 5.3涡旋振荡器.5.4冷冻离心机：转速大于5000r/min.5.5固相萃取装置.5.6真空泵.5.7氮气吹干仪.5.8pH计：测量精度士0.02. 5.9刻度样品管：10mL.精度为0.1mL
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用.
牛奶置于0C～4C冰箱中避光保存，奶粉常温避光保存.
7测定步骤
7.1提取
牛奶试样称取10g（精确到0.01g），置于50mL具塞塑料离心管中.奶粉试样称取2g（精确到0.01g)，置于50 mL具塞塑料离心管中.向试样中加人 20 mL 0. 1 mol/L NaEDTA-Mellvaine 缓冲溶液（4.10），于锅旋振荡器上混合2min，于10C，5000r/min离心10min，上清液过滤至另一离心管中.残渣中再加人20mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液.
7.2净化
将上清液（7.1）通过处理好的OasisHLB柱（4.17），待上清液完全流出后，用5mL甲醇-水（4.12）淋洗，弃去全部流出液.减压抽干5min，最后用5mL甲醇（4.1）洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中.
1)Oasis HLB 国相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可，如果其他产品具有相同的效果.则可使用这些等效产品.
将收集的洗脱液通过羧酸型阳离子交换柱（4.18）.待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇（4.1）洗柱，减压抽干，用4mL0.01mol/1草酸-乙溶液（4.13）洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中，45C氮气吹至1.5mL左右，流动相定容至2mL.供液相色谱-紫外检测器测定.
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：Kromasil 100-5Cis，5pμm 150mm×4.6mm（内径）或相当者：c）流速：1.OmL/min; b）流动相：0.01mol/L草酸溶液-乙晴-甲醇（77185）；d）柱温：40C：e）检测波长：350nm；f）进样量：60ul
7.3.2液相色谱测定
将混合标准工作溶液（4.16）分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为3.09min、中的图A.1. 3.73min、8.27min和12.53min.土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图参见附录A
7.4平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定.
7.5空白试验
除不称取试样外，按以上步骤同时完成空白试验.
7.6回收率试验
向阴性试样中添加标准溶液，均按上述步骤操作，测定后计算试样中添加的回收率.添加浓度及回收率范围参见附录B中的表B.1.
8结果计算
被测物残留量的测定按式（1)计算：
.（1)
式中：
X.-一试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；.-从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度；单位为纳克每毫升（ng/mL)；V-样品溶液定容体积，单位为毫升（mL)；-样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）.计算结果应扣除空白值.
9精密度
9.1一般规定
值是以95%的可信度来计算. 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，牛奶和奶粉中土霉素、
