中华人民共和国国家标准
GB/T22988-2008
牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、 竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of spiramycin.pirlimycin，oleandomycin，tilmicosin erythromycin and tylosin residues in milk and milk powderLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.本标准主要起草人：郭春海、艾连峰、段文仲、陈瑞春、马育松、窦彩云、刘宝圣、张增利、庞国芳.
竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素 牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中螺庭霉素、毗利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的高效液相色谱-申联质谱测定方法.
测定和确证. 本标准适用于牛奶和奶粉中螺庭霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的
本标准的方法检出限：牛奶为1μg/kg，奶粉为8μg/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
用乙睛提取试样中的分析物，固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙睛，液相色谱纯. 4.2甲醇，液相色谱纯.4.3乙酸，液相色谱纯.4.4甲酸铵，液相色谱纯.4.5磷酸氢二钠.4.6氢氧化钠. 4.7甲醇-水溶液（37）：300mL甲醇与700mL水混合.4.85mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，用水溶解，定容至100ml.4.90.1mol/L磷酸盐缓冲溶液：6g磷酸氢二钠（4.5）溶解于450mL水中.用氢氧化钠（4.8）溶液调节pH=8.加水至500mL.使用前配制.4.100.1mol/L甲酸铵溶液：0.63g甲酸铵（4.4）加水溶解至1000mL. 4.11标准品：螺旋霉素（spiramycin，CAS：8025-81-8）、毗利霉素（pirlimycin，CAS:79548-73-5）、竹桃霉素（oleandomycin，CAS：7060-74-4）、替米卡星（tilmicosin，CAS：108050-54-0）、红霉素（erythromycin，
CAS：114-07-8）、泰乐菌素（tylosin，CAS：1401-69-0)，纯度均大于等于98%.4.12标准储备液：分别精确称取适量标准品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液.4.13混合标准中间工作液：取标准储备液（4.12）各1mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配 制成混合标准工作液，浓度为1pg/mL.4.14滤膜；0.45 pm.4.15HLB固相萃取柱或相当者：500mg.6mL.使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL磷酸盐缓冲溶液（4.9）预处理.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2离心机：转速大于3000r/min5.3旋涡混合器. 5.4旋转蒸发仪.5.5氮吹仪.5.6固相萃取装置，
6试样的制备与保存
6.1牛奶取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4C下保存，并标明标记.6.2奶粉取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记.
7测定步骤
7.1提取
7.1.1牛奶
称取4g，准确至0.01g.牛奶样品于50mL具塞离心管中，加人20mL乙晴振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取上清液过滤至鸡心瓶中.再用10mL乙晴重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中.
7.1.2奶粉
晴振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取上清液过滤至鸡心瓶中.再用10mL乙晴重复提 称取0.5g，准确至0.01g，奶粉样品，加人4mL水于50mL具塞离心管中，混匀.加人20mL乙取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中.
7.2净化
件化的HLB固相萃取柱（4.15）上.再用2mL磷酸盐缓冲液洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到柱上，以 将提取液于45C下旋转蒸发至约4mL左右，加入2mL磷酸盐缓冲液（4.9），混匀后，转移到已条小于2mL/min流速滴下.接着依次用3mL水和2mL甲醇-水溶液（4.7）淋洗并抽干柱，最后用6mL乙洗脱并收集于10mL带刻度的玻璃管中（此过程流速小于2mL/min）.洗脱液在45C水浴上氮气吹至约1mL，用甲酸胶溶液（4.10）定容至2mL，涡旋混合后，过0.45μm滤膜供HPLC-MS-MS 分析.
7.3空白基质溶液的制备
将取牛奶阴性样品4g，奶粉阴性样品0.5g.精确到0.01g，按7.1和7.2操作.
1）HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可.如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：苯基柱，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者；b) 色谱柱温度：30C；c) 进样量：15pl;d）流动相梯度及流速见表1.
表1液相色谱梯度洗脱条件
0.00 流速/(μL/min) 200 0.1%甲酸水溶液/% 0 甲醇/% 206 00 200 20 808 00 200 20 808.01 10.0 002 200 80 08 20 20
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI）：b）质谱扫描方式：多反应监测（MRM）：d) 鞘气压力：104kPa; 辅助气压力：138kPa;e) 正离子模式电喷雾电压（IS）：4000V；f) 毛细管温度：350C；h）Q1为0.7 Q3为0.7； 源内诱导解离电压：10V；i) 碰撞气：高纯氢气：j）碰撞气压力：0.2 Pa；k）参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表2.
表2参考保留时间、监测离子对和裂解能量
化合物名称 保留时间/min 监测离子对（m/=） 843 50/173 87* 裂解能量/eV 36螺旋霉素 4 73 843 50/540 09 29吡利霉素 4.78 411 12/111 98* 25411. 12/363 02 14竹桃霉素 5 62 688 46/158 20* 688 46/544 30 35 20869 57/173 83* 41皆米卡星 5 83 869 57/155 89 37红霉素 6 12 734 18/157 88* 33916 36/173 80* 734 18/576 13 20 38秦乐菌素 6 33 916 36/772 18 28为定量离子对，对于不同质谐仪容，仅器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最住.
