中华人民共和国国家标准
GB/T23187-2008
Determinationofluteininfeeds-High performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口.
本标准起草单位：华中农业大学、广州汇标检测技术中心、广州立达尔生物科技有限公司、佛山市南海区维德生物技术有限公司.
本标准主要起草人：齐德生、于炎湖、陈红、陶正国、高俊勤、邝金媚、辜垂鹏、黄楷彬、孙玉国、张妮娅.
饲料中叶黄素的测定高效液相色谱法
1范围
本标准规定了高效液相色谱法测定饲料中叶黄素的方法.
为0.5 mg/kg 本标准适用于单一饲料、添加剂预混合饲料、浓缩饲料及配合饲料中叶黄素的测定.方法的定量限
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987 MOD）GB/T 14699.1饲料采样（GB/T 14699.1-2005，1SO 6497:2002IDT)GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195-2006 ISO6498:1998，IDT）
3原理
试样中叶黄素经碱液皂化及有机溶剂提取后，取上清液过滤注人高效液相色谱仪进行分离，用紫外检测器检测，外标法计算叶黄素的含量.
4试剂和材料
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂，用水符合GB/T6682中一级水的规定.
4.1正已烷. 4.2丙酮.4.3无水乙醇.4.4甲苯4.5甲醇， 4.6异丙醇.4.7氢氧化钾.4.8无水硫酸钠.00由由8（80）由 4.9提取剂：正已烷-丙酮-无水乙醇-甲苯（34232023）混合液.4.11硫酸钠溶液（100g/L）：10g无水硫酸钠溶于100mL水中.4.12叶黄素标准储备液：准确称取叶黄素标准品（含量大于99.0%）2mg（精确至0.1mg），先加人少4.13叶黄素标准工作液：取叶黄素标准储备液（4.12）用流动相逐级稀释成0.5μg/mL、1.0pg/mL、 量流动相超声溶解，用流动相定容至100mL棕色容量瓶，作标准储备液，4C避光保存，保存期3天.2. 0 μg/mL、5. 0μg/mL、10.0 μg/mL、20.0μg/mL系列标准工作液.
5仪器
5.1恒温水浴锅. 5.2分析天平：感量0.0001g.5.3高效液相色谱仪：配UV-VIS检测器.
5.4旋转蒸发仪.5.5分液漏斗：250ml.5.6分析实验室常用玻璃仪器.
6试样的制备
按GB/T14699.1采集有代表性的样品，按GB/T20195进行样品制备.粉碎过0.45mm孔筛，混合均匀，装人密闭容器中，低温保存备用.
7分析步额
7.1试样溶液的制备
警告一一整个制备过程应避光操作！
称取试料1g~5g（m），精确到0.0001g，置于100mL棕色容量瓶中.加人30mL提取剂（4.9），塞紧，旋转振据1min.加人2mL40%氢氧化钾甲醇液（4.10）于容量瓶中，旋转振摇1min，将容量瓶接上空气冷凝装置或塞紧瓶塞，置于50C~60C水浴中加热20min.于暗处放置1h.加人20mL正已烷（4.1），旋转振摇1min，加人10%硫酸钠溶液（4.11)50mL，转移到250mL分液漏斗（5.5）中，猛 烈振摇1min，于暗处放置1h，取出上层溶液：水相分别加人20mL正已烷（4.1）提取两次，合并上层液，于旋转蒸发仪中50C～60C水浴浓缩至干，根据样品中叶黄素含量高低，残余物加正已烷（4.1）10mL~100mL（V），充分溶解后经0.45pm滤膜过滤，滤液备用.取20pL滤液在高效液相色谱仪上测定叶黄素组分的峰面积，根据标准工作曲线（7.2.2）计算滤液中叶黄素的浓度（c）.
7.2测定
7.2.1色谱条件
色谱柱：硅胶柱（5.0μm，250mm×4.6mm）.流动相：正己烷-乙酸乙酯-异丙醇（73271.5）混合液. 流速：1.5mL/min柱温：室温.进样量：20L检测器：紫外检测器使用波长446nm.
7.2.2标准工作曲线的绘制
各取20L叶黄素标准工作液上机进行高效液相色谱分析.以浓度（c）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，做标准工作曲线.
8结果计算
饲料中叶黄素含量X，以质量分数[毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算.
式中：
c-由标准工作曲线查得的试样滤液中叶黄素的浓度，单位为微克每毫升（gug/mL）；
V加入正已烷的体积（7.1)，单位为毫升（mL）；m称样量，单位为克（g）.
测定结果用平行测定后的算术平均值表示，结果表示到o.1mg/kg.
9精密度
50mg/kg时，不得大于15%：含量大于50mg/kg时，不得大于10%. 对同一样品同时或快速连续地进行两次测定，所得结果的相对偏差：叶黄素含量小于或等于
