中华人民共和国国家标准
GB/T 23409-2009
蜂王浆中土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法
Determination of residues of oxytetracycline，tetracyclinechlortetracycline，and doxyeycline in royal jelly-LC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.本标准主要起草人：徐锦忠、丁涛、张晓燕、魏云计、章字、刘艳、李丽花、吴斌、蒋原、陶宏锦.
蜂王浆中土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了蜂王浆中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法.本标准适用于蜂王浆中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素残留量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3方法提要
试样用提取液提取后，调节溶液的pH值，用固相萃取柱萃取，洗脱液浓缩后用甲醇水溶液定容，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
除非另有说明，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2甲酸：色谱纯. 4.3三氯乙酸.4.4氢氧化钠.4.5甲醇-水：（28，体积比）：量取20mL甲醇（4.1）与80mL水混合.4.6甲醇-水：（37，体积比）：量取30mL甲醇（4.1）与70mL水混合.4.71%三氯乙酸水溶液：称取10g三氯乙酸于200mL水中，溶解后，加水至1L. 4.81.0mol/1磷酸氢二钠水溶液：称取358g磷酸氢二钠（NaHPO 12HO）于600mL水中，溶解后，加水至1L.4.9四环素（Tetracycline，CAS号：64-75-5）、土霉素（Oxytetracycline CAS号：2058-46-0）、金霉素（Chlortetracycline，CAS号：57-62-5）、强力霉素（Doxycycline，CAS号：24390-14-5）标准物：纯度4.10四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物标准储备溶液：1.0mg/mL.准确称取适量的四环素、土 ≥95%.霉素、金霉素、强力霉素药物标准物质，用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液，储备液贮存在一18C冰柜中，可使用6个月.4.11空白样品提取液：用不含四环素类药物残留的样品，按照7.1制备空白样品溶液.4.12四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物标准工作溶液：用空白样品提取液（4.11）分别配成四环 素、土霉素、金霉素、强力霉素药物浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、
200ng/mL标准工作溶液标准工作溶液在4C保存，现用现配.
GB/T 23409-2009
4.13聚苯乙烯吡咯烷酮填料固相萃取柱或相当者：60mg.3mL.使用前分别用5mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润.
4.14滤膜：0.45μm，水相.
5仪器与设备
5.1液相色谱-质谱仪（中联四极杆）：配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量分别为0.1mg和0.01g 5.3自动浓缩仪或相当者.5.4液体混匀器.5.5真空泵：真空度大于或等于80kPa.5.6移液器：10mL，5.7离心管：50mL，具塞， 5.8刻度离心管：10ml.5.9离心机：8 000 r/min.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将实验室样品，自然解冻至室温，搅拌均匀，分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记.在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样的保存
贮存在一18C冰柜中.
7测定步额
7.1提取
称取2g试样（精确到0.001g），置于50mL具塞离心管中.加人15mL1%三氯乙酸溶液（4.7），于液体混匀器上快速混合2min，6500r/min离心5min，取10mL上清液，用1mol/LNaHPO （4.8）调节pH值为6.0~7.0.将溶液以1mL/min左右的流速通过固相萃取柱，待溶液完全流出后，用5mL水洗离心管并过柱，然后再用5mL甲醇-水（4.5）洗柱，弃去全部淋出液.在65kPa的负压下，减压抽干10min，最后用5mL甲醇（4.1）洗脱，收集洗脱液于10mL刻度离心管（5.8）中，于50C用氮气 吹干仪吹干，用甲醇-水（4.6）定容至1.0mL，过0.45pm的滤膜（4.14）到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定.
7.2测定
7.2.1液相色谱条件
a）色谱柱：高纯硅胶C柱，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）流动相：0.1%甲酸水溶液甲醇，梯度参见附录A；c）流速：0.25ml/min;e）进样量：25p d）柱温：室温；
7.2.2质谱条件
参见附录B.
7.2.3液相色谱-质谱测定
四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物标准工作溶液（4.12）在液相色谱-质谱设定条件下分别进样，以样品峰面积为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物的响应值均应在仪器测定的线性范2
围内，在上述色谱条件下，药物参考保留时间分别为四环素5.82min，土霉素6.05min，金霉素6.96min，强力霉素7.75min.谱图参见附录C.
7.2.4阳性样品的确证
按照上述（7.2.1~7.2.3）条件测定样品和标准工作液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准工作液一致，允许偏差小于土2.5%：定性离子对的相对丰度与浓度相当标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在相应的被测物.
表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
允许的相对偏差 相对离子丰度 >50% ±20% >20%~50% ±25% >10%~20% ±30% ≤10% ±50%
7.3空白试验
除不称取试样外，均按上述（7.1~7.2）步骤进行.
8结果计算
结果按式（1)计算：
**( 1 )
式中：
X-试样中被测组分残留量.单位为毫克每千克（mg/kg）；.--由标准曲线面得的样液中药物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）：Cai 由标准曲线面得的空白试验中药物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）：样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）. 样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
9测定低限和回收率
9.1测定低限
本标准测定低限：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素均为0.005mg/kg.
9.2回收率
回收率见表2.
表2土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其回收率范围的试验数据
回收率范围/%药物名称 添加浓度/（mg/kg） 0 005 85. 2~114 4土霉素 0 010 93 6~120 20 040 88 6~120 8四环素 0 010 0 005 76 4~103 0 92. 2~115 40 040 73. 5~100 10 005 107 0~123 6金霉素 0 010 0 040 86. 6~102 6 71 3~89.80 005 80 8~115 2强力霉素 0 010 65 8~76 90 040 71 8~100 6
