中华人民共和国国家标准
GB/T23814-2009
Protocol of the polymerase chain reaction fordetecting kidney beans ponents in lotus foods
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由中国标准化研究院提出并归口，
本标准负责起草单位：国家加工食品质量监督检验中心（广州）、广州市质量监督检测研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：蔡依军、覃芳芳、罗海英、邓鸿铃、郭新东、吴玉銮、蓝芳.
莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法
1范围
本标准规定了莲蓉制品中芸豆成分的定性PCR检测方法.本标准的检出限为0.5ng芸豆DNA. 本标准适用于由莲蓉制品半成品和成品中芸豆成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696:1987，MOD）
3术语和定义
GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本标准.
4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行.
5抽样和制样
按照GB/T19495.7规定的方法执行.
6测定方法
6.1原理
DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有芸豆成分. 样品经DNA提取后，针对芸豆特异基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增芸豆基因的
6.2试剂和材料
除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水.
6.2.1引物：检测莲蓉制品内源基因和芸豆特异基因的引物及其信息见表1.
表1莲蓉制品内、外源基因所需的引物信息
检测基因 引物序列 PCR产物大小/ bp 基因性质 适用范围NNEA0732 反;5′-CATGGGCTAACCAACTAGACAGC-3' IE:5′-GTAGAATCGGCACTGGAGGTAG-3′ 142 莲子特异基因 莲荐制品正:5′-CAGACATTTCATATCCAGGGAGG-3* 基AB070627 反：5′-TGAATTGTACGGTGAAGGATGG-3′ 194 芸豆特异基因
GB/T 23814-2009
6.2.2琼脂糖：电泳纯.6.2.3Tris饱和酚.6.2.4三氯甲烷. 6.2.5冰乙酸，6.2.6无水乙醇.6.2.7异戊醇.6.2.8异丙醇.6.2.9氢氧化钠（NaOH）. 6.2.10盐酸（HCI）.6.2.12乙二胺四乙酸钠盐（NaEDTA）.6.2.13蔗糖.6.2.14溴酚蓝. 6.2.15乙酸钠（NaAc).6.2.16苯酚三氯甲烷异戊醇（25241，体积比）.6.2.17三氯甲烷异戊醇（241，体积比）.6.2.191×TAE电缓冲液：取50×TAE（242gTris 57.1mL冰乙酸，100ml0.5mol/L 6.2.183mol/L乙酸钠：3mol/L乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.2.NaEDTA，用HCI或Na(OH调节pH至8.0，定容至1 L)按比例稀释.6. 2. 20 TE缓冲液:Tris 0.01 mol/L Na;EDTA 0. 001 mol/L 用 HC1或 NaOH 调节 pH 至 8. 0.6.2.21PCR试剂盒：Taq酶，dNTPs，10×Buffer，氯化镁（MgCl）.6.2.22上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖溶液. 6.2.23溴化乙锭溶液：1mg/ml.6.2.2470%乙醇.6.2.25等效DNA提取试剂盒.6.3主要仪器6.3.1PCR热循环仪.6.3.3凝胶成像系统.6.3.5涡旋振荡器.6.3.6分析天平；0.1g.6.3.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.4检测步骤 6.4.1模板DNA的提取6.4.1.1对照设置阳性对照：莲子基因组DNA、芸豆基因组DNA；阴性对照：已知以不含该基因的样品提取的DNA； 空白对照：双蒸水（ddHO）.6.4.1.2DNA提取步骤a）样品DNA提取时设双平行；2
6.2.11三羟甲基氨基甲烷（Tris）.6.2.26DNA分子质量标准品（50bp）.6.3.2电泳仪.6.3.4离心机：12 000 r/min6.3.7微量可调移液器：0.5μL，2pl，10pL，20 μL，100pL.200μL，1 000 μl
b）将样品粉碎，取适量样品，加人400LTE缓冲液（6.2.20），将沉淀完全溶解；c）加人与溶液等体积苯酚三氯甲烷异戊醇（25241)（6.2.16），重复混匀10min；e）加入与上清液等体积三氯甲烷异戊醇（241）（6.2.17），重复混匀10min； d) 12000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一干净的1.5mL离心管中：f）12000r/min室温离心10min，小心吸取上清液：g）加人上清液1/10体积3mol/L乙酸钠（6.2.18），加人2倍~2.5倍体积经-20C预冷的无水乙醇（6.2.6），颠倒混匀后一20C静置1h：或加人等体积异丙醇（6.2.8），混匀后室湿静置h）15 000r/min，室温离心10min，弃去上清液； 10 min:i）70%乙醇（6.2.24）洗涤沉淀2次~3次，干燥DNA；j）50uL0.1×TE（6.2.20）溶解沉淀，4C保存.也可以用等效DNA提取试剂盒（6.2.25）提取样品DNA，按试剂盒操作说明书指示操作.
6.4.2DNA质量的测定
样品中提取的DNA质量的测定用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（6.3.8）进行测定.
取适量DNA溶液加TE缓冲液（6.2.20）进行稀释，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和 280nm 处的吸光值A和As.DNA的浓度按式（1)计算：
式中：
DNA 浓度μg/μL;
A-260nm处的吸光值；
N---核酸稀释倍数.
当A/A比值在1.4以上时，可用于PCR扩增，1.7~2.0之间时，PCR扩增效果好.
6.4.3PCR扩增
6.4.3.1PCR反应体系
性对照、阴性对照和空白对照. 检测样品内、外源基因的PCR反应体系见表2.每个反应体系应设置两个平行反应.同时设置阳
表2PCR反应体系
加入PCR反应体系的体积/试制名称 贮备液浓废 xl.10 × PCR Buffer 2 5MgCl: 25 mmol/L 2 5dNTP 2 5 mmol/1 2 0正：0 25Primers 20 pmol/μL 反：0.25Taqg 5 U/yl 0 15Template 0 1 μg/pl.~0 2 pg/x1 1ddH:0 补足反应体系总体积为25
见表3.
