中华人民共和国国家标准
GB/T23874-2009
饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法
Determination of xylanase activity in feed additives-Spectrophotometric method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口.
本标准由中国农业大学农业部饲料工业中心、武汉新华扬生物有限公司、广东溢多利生物技术股份有限公司负责起草.
本标准主要起草人：陆文清、曹云鹤、刘兴海、詹志春、刘亚力、陈清华.
饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法
1范围
本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中本聚糖酶的活力.本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出量为10.0U/g-
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
本聚糖酶能将木聚糖降解成赛糖和单糖.还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应.反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成中木聚糖酶的活力. 量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比，因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液
在37C、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U.
4试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水.
4.1氢氧化钠溶液，浓度为200g/L
称取氢氧化钠20.0g.加水溶解，定容至100mL.
4.2乙酸溶液，浓度为0.1mol/L
吸取冰乙酸0.60mL.加水溶解，定容至100mL.
4.3乙酸钠溶液，浓度为0.1mol/L
称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解，定容至100ml.
4.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液，浓度为0.1mol/L.pH为5.50
称取三水乙酸钠23.14g，加人冰乙酸1.70mL.再加水溶解，定容至2000mL.测定溶液的pH.如果pH偏离5.50.再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.50.
4.5木糖溶液（CHoO）.浓度为10.0mg/mL
称取无水木糖1.000g，加乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100mL.
4.6木聚糖溶液，浓度为100mg/ml
称取木聚糖（SigmaX0627）1.00g.加人0.32g氢氧化钠，再加人90mL水，磁力搅拌，同时缓慢
1）SigmaX0627是商品名，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可.如果其他产品能有相同的效果，则可使用这些等效的产品.
加热，直至木聚糖完全溶解.然后停止加热，继续搅拌30min，加人0.5mL冰乙酸.继续磁力搅拌，测定其pH.如果pH为5.50，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100mL.如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.50，然后再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100mL.使用前适当摇匀.4C避光保存，有效期为12h.
4.7DNS试剂
称取3，5-二硝基水杨酸3.15g.加水500mL.搅拌3s~5s，水浴至45C.然后逐步加人100mL氢氧化钠溶液（4.1）.同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48C）.再逐步加人四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45C水浴 加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加人的物质完全溶解.停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存.室温下存放7d后方可使用，有效期为180d.
5仪器与设备
5.2分样筛：孔径为0.25mm. 5.1实验室用样品粉碎机或碾体.5.3分析天平：感量0.001g5.4pH计：精确至0.01.5.5磁力搅拌器：附加热功能.5.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m 5.6电磁振荡器.5.8离心机：最大离心加速度不小于2000g.5.9恒温水浴锅：温度控制范围在30C~60C之间，精度为0.1C.5.10秒表：每小时误差不超过5s.5.12移液器：精度为1. 5.11可见分光光度计.
6绘制标准曲线
6.1吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）4.0mL，加入DNS试剂（4.7）5.0mL，沸水浴加热5min.用自6.2分别吸取木糖溶液（4.5)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL.6.00mL和7.00ml， 来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样.分别用缓冲溶液（4.4）定容至100mL.配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0. 40 mg/mL、0. 50 mg/mL0. 60 mg/mL 和 0. 70 mg/mL 木糖标准溶液.6.3分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加人到刻度试管中，再分用自来水冷却到室湿，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度 别加入2.0mL缓冲液（4.4）和5.0mLDNS试剂（4.7）.电磁振荡3s~5s 沸水浴加热5min.然后
A值.
以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X输，绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.
7反应用酶液的制备
7.1固体样品的反应用酶液制备
按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.001g.加入40mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液2
（4.4）.磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（4.4）定容至100mL，在4C条件下避光保存1h~2h.上离心机（5.8）1000g离心3min~5min，取上清液，再用缓冲溶液（4.4）做适当稀释（稀释后的待测酵液中本聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL~0.10U/mL之间）.
7.2液体样品的反应用酶液制备
好能控制在0.04U/mL~0.10U/mL之间）.如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液 液体样品可以直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖酶活力最（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节校正至5.50.然后再用缓冲溶液（4.4）做适当稀释定容.
8测定步骤
吸取10.0mL本聚糖溶液（4.6）.37C平衡20min.
吸取10.0mL经过适当稀释的酶液（7.1或7.2）.37C平衡10min.
吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37C平衡）.加入到刻度试管中，再加人5mLDNS试5min.用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s~5s.以标准空白样（6.1)为空白对照， 剂（4.7），电磁振荡3s~5s.然后加人2.0mL木聚糖溶液（4.6），37C保温30min，沸水浴加热在540nm处测定吸光度Ag.
吸取2.00mL经过适当稀释的酵液（已经过37C平衡），加人到刻度试管中，再加人2.0mL木聚糖（4.6）（已经过37C平衡），电磁振荡3s~5s.37C精确保温30min加人5.0mLDNS试剂（4.7），电磁振荡3s~5s，以终止酶解反应.沸水浴加热5min，用自来水冷却至室湿，加水定容至25mL，电磁振荡3s~5s.以标准空白样（6.1）为空白对照，在540nm处测定吸光度Ag.
9试样酶活力的计算
用于酶解反应的稀释酵液中木聚糖酶的活力按式（1）和式（2）计算：
式中：
X-稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/mL； Ae酶反应液的吸光度；As-一酶空白样的吸光度；K--标准曲线的斜率；Co-标准曲线的截距；M-木糖的摩尔质量，M（C;HO）=150.2g/mol；{-酶解反应时间，min；
1 000--转化因子，1 mmol=1 000 ymol
X值应在0.04U/mL~0.10U/mL之间.如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定.
式中：
X试样中木聚糖酵的活力.U/g（或U/mL）；
D试样的稀释倍数.
