中华人民共和国国家标准
GB/T25168-2010
Technical regulation of farm animals cDNA library construction and preservation
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所. 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口本标准主要起草人：马月辉、关伟军、陆涛峰、李向臣、佟春玲、余露露、刘鹏.
畜禽cDNA文库构建与保存技术规程
1范围
本标准规定了畜禽cDNA文库构建方法.本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽cDNA文库构建与保存.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1cDNA plementary deoxyribonucleic acid
以成熟mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的cDNA链.
cDNA文库cDNA library
反应合成双链cDNA群体后，再插人到适当的载体上，经转化寄主菌株构成特定的cDNA克隆群体. 将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA，经过反转录等一系列的生化
3. 3
寡核苷酸oligonucleotide
3. 4
噬菌斑plaque
被噬菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体，会继续感染周围的细胞，致使在琼脂平板上生长的菌苔中有大量的细胞发生裂解，形成的透明区域.
4试剂及溶液配制
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682一级用水的要求.
4.1焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）处理水
在1000ml去离子水中加人1mLDEPC，37℃静置12h，高压灭菌（120℃30min）.
4.2 2 mol/L MgSO
称取 246.50g MgSOH;O 加 400 mL双蒸水（double distilled H;O ddHO）溶解后，定容到500mL，高压灭菌.
4.310 mmol/L MgSO;
量取1ml2mol/LMgSO 加 ddHO定容到200 mL，高压灭菌，30 min.
4. 4 1 mol/L Tris-CI(pH7. 5)
称取121.14gTris，碱溶于800mL. ddH-O中，调pH至7.5，定容到1 L，高压灭菌.
称取 5. 80 g NaC1.2. 00 g MgSO * 7H; O 量取 50 ml 1 mol/L Tris-C1(pH7. 5)和 5 mL 2%(质
GB/T 25168-2010
量浓度）明胶，定容到1L，高压灭菌.
4.65×-链缓冲液
250 mmol/L Tris(pH8 3) 30 mmol/L MgCl; 375 mmol/L KC1.
4.710XDNA连接酶缓冲液
500 mmol/L Tris-Cl( pH7. 8) 100 mmol/L MgCl; 100 mmol/L 二 硫苏糖醇(dithiothreitol DTT) 0. 5 mg/mL 牛血清白蛋白(bovine serum albumin BSA).
4.8LB液体培养基
取10.00gNaC1、10.00g细菌培养用胰蛋白陈和5.00g细菌培养用酵母提取物加1LddHO溶解后，高压灭菌.
4.9LB固体培养基
养用琼脂加1LddHO溶解后，高压灭菌. 取10.00gNaC1、10.00g细菌培养用胰蛋白陈、5 00g细菌培养用酵母提取物和 20.00g细菌培
4.10LB顶层培养基
将0.70g琼脂糖加人100mLLB液体培养基中，高压灭菌.
4.1120%麦芽糖
取20.00g麦芽糖溶于100mLddHO中，过滤除菌.
5主要仪器、设备
低温冰箱、凝胶自动成像分析系统和低温离心机等. 水浴锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪、一80℃
6cDNA文库构建
6.1样品采集
畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料.将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中，或剪切成1mm²大小的组织碎块后放人RNA保存液中.
6.2总RNA提取
品磨碎，加人1mLTrizol（含有酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉和3疏基乙醇的单相液），混匀后移至经 使用TRIzol法提取畜禽组织的总RNA.在不断填充液氮的研钵中将30mg~100mg的组织样DEPC处理水浸泡过的离心管中，静置5min.加人200μL三氯甲烷，混匀，静置2min~3min，4℃下，13200g离心15min.移上清至另一离心管中，加人400μL异丙醇，混匀后静置10min，4℃下， 13200g离心10min，弃上清，用DEPC处理水配制的75%乙醇洗涤沉淀2次，室温静置5min~10min，晾干后用50uL~100pL的DEPC处理水溶解沉淀后用1%变性琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖0.3g，DEPC处理水21.6mL，10×Mops3mL 37%甲醛5.4 mL，核酸显示剂2pL~3L)检测 RNA质量，于一80C冰箱中保存.
6.3cDNA合成
6.3.1cDNA第一链合成
采用5'末端RNA转录子转换机制（switching mechanism at5′endof the RNAtranscript，SMART）技术合成全长cDNA 双链.首先取一PCR管分别加人0.05μg~1.0pg总RNA 样品.1.0 μL 10 μmol/L 经过修饰的 Oligo（dG）的寡核苷酸和 1. 0 pl 10 mmol/L 经过修饰的Oligo（dT）3 引物，添加DEPC处理水使总体积达到5.0gL，混匀，72C下放置2min，冰浴2min.然后，分别加人2.0μL5×一链缓冲液、1.OμL20mmol/LDTT、1.0L10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribo-nucleoside triphosphate dNTP)和 1. 0 μL 200 U/yuL Primerscrip反转录酶，混匀，42C下放置1 h，冰浴2min终止反应后进行下一步操作或一20C下短期保存.
6.3.2cDNA第二链的合成
取一PCR管分别加人2.0L一链cDNA、80μLddH:O、10pL 10×Exfag缓冲液、2.0yL
2. 5 mmol/L 50 ×dNTP 2. 0 μL 10 μmol/ L 5引I物 2. 0 pL 10 μmol/ L 经过修饰的 Oligo(dT)3′引|物和2.0L5U/μLExtag酶，总体积为100μL，混匀，95C预变性25 s后，95℃变性25 s 68℃退火延伸6min，共21个循环.用1.1%琼脂糖对5.0gLPCR产物进行电泳检测，双链cDNA的分布范围在 0. 1 kb~4. 0 kb 之间.
引物序列为：
5引物序列 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-33引物序列 5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_N-3
(N=A G C或T;N=A，G或 C)
6.4cDNA的纯化、酶切与分离
6.4.1cDNA 的纯化
下放置20min.然后加入50plddH；O和100L苯酚-三氯甲烷-异戌醇（2524=1）混匀，13200g 取一PCR管分别加人50μL2.0μg~3.0μg双链cDNA、2.0L20μg/μL蛋白酶K，混匀，45℃离心5min.移上清至另一离心管中，加人100gL三氯甲烷-异戊醇（24：1），混匀，13200g离心5min.移上清至另一离心管中，分别加人10μL3mol/L乙酸钠（pH4.8）、1.3pl20pμg/μL肝糖元、260pL95%乙醇，13200g离心20min.弃上清，用100gL 80%乙醇洗涤沉淀后干燥10min，然后加人79μL ddHO溶解沉淀.
6.4.2cDNA的酶切
1.0μL100×BSA，总体积为100pL，混匀，50℃下放置2h，加2.0μL1%的二甲苯胺指示剂，混匀. 取一PCR管分别加人79μL双链cDNA、10xL10×SfiI缓冲液、10L20U/μLSfiI内切酶和
6.4.3cDNA的分离
重悬分离柱内容物，自然滴尽柱中溶剂，加入700pL柱缓冲液，滴尽.加人100pL酶切产物，滴尽.加人100μL柱缓冲液，滴尽.加入600μL柱缓冲液，用16支离心管分别逐滴收集，每管一滴.每 管取3.0μL样品，用1.1%琼脂糖凝胶进行片段大小检测，收集300bp以上的cDNA片段于一离心管中、分别加人1/10体积3mol/L乙酸钠（pH4.8）、1.3μL20mg/mL肝糖元和2.5体积95%乙醇，混匀，20℃下沉淀12h.4C下，13200g离心20min，弃上清，干燥10min.7.0μL ddHO溶解沉淀，混匀，一20℃C保存.
6.5cDNA片段与载体的连接
取-PCR管分别加人100 ng的 cDNA、1.0pμL 500 ng/μL XTripl Ex2载体、0.5 μL 10× DNA连接缓冲液、0.5μL 10 mmol/L三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP)、0.5 μL 400 U/μL T4 DNA连接酶，加ddHO使总体积达到5.0pL，混匀，16℃下连接12h.
6.6cDNA重组体的包装
解冻包装蛋白抽提物，取10L，加人4.0L连接产物，混匀，22℃下包装2h后加人500pLSM缓冲液和20uL三氯甲烷，混匀，进行未扩增文库滴度测定或4C保存.
7文库的扩增与保存
在含10mmol/1.MgSO终浓度为0.2%麦芽糖的LB液体培养基中培养VCS257菌，使细菌OD值为2.0 1000g离心10min，然后用10mmol/LMgSO 重悬细胞，调OD值至4.0.分别在20个离心管中加人500gL的菌液和足够形成6.0×10个~7.0×10个噬菌斑的稀释包装液，37℃C故置15min后加到3mLLB顶层培养基中，混匀，立即倒人LB琼脂平板中，涂匀，37C放置6h~18h，直至噬菌斑相互接 触后，每个平板上再加12mLSM缓冲液，4C放置12h后，50r/min，37C振荡培养1h，最后将噬菌体溶解物移至50mL离心管中，加人10mL三氯甲烷，混匀，2000g离心10min，再将上清液转移到另一离心管，加二甲基亚矾（dimethyl sulfoxide，DMSO）至终浓度为7%后分装，一70℃长期保存.
