中华人民共和国国家标准
GB/T26348-2010
Test methods of mosquito resistance to insecticidesTest methods of insensitive acetylcholinesterase for the mosquito
中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口.
本标准起草单位：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、中国农业大学、北京市疾病预防控制中心
本标准主要起草人：赵彤言、汪中明、李春晓、董言德、高希武、曾晓芃、佟颖.
不敏感乙酰胆碱酯酶法 蚊虫抗药性检测方法
1范围
本标准规定了蚊虫体内不敏感的乙酰胆碱酯酶（AChE）的检测方法.
本标准适用于淡色库蚊（Culexpipiens pallens） 致倦库蚊（Cx.pipiens quinquefasciatus）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）、中华按蚊（Anophelex sinensix）等对有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂抗性的生物化学检测.
2术语和定义
下列术语和定文适用于本文件.
2. 1 乙酰胆碱酯酶区分浓度discriminating concentrationofacetylcholinesterase
能够抑制敏感蚊虫乙酰胆碱酯酶生理活性90%的杀虫药剂的浓度.
3试虫
现场多点采集幼虫，室内饲养，采用羽化后3d~5d未吸血雌蚊进行检测，冰浴条件下储存不超过
4试剂
4.1磷酸氢二钠（NaHPO），分析纯.4.2磷酸二氢钾（KHPO）.分析纯.4.4乙酰硫代胆碱（ATCh），分析纯. 4.3曲拉通 X-100(Triton X-100).4.55，5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB），分析纯.4.6磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH7.5 PBS)：称取 30.18g Na;HPO 12HO 和 2.16 g KH-PO ，蒸馏水定容至1000mL 4.7DTNB-乙醇显色剂：12.4mgDTNB.加120mL95%乙醇，80mL蒸馏水，50mL磷酸盐缓冲液 (pH7. 5，0. 1 mol/L 含 0. 1% Triton X-100).4.8ATCh溶液：称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中，-20C避光保存.4.9ATCh-DTNB混合溶液：称取75mgATCh和13mgDTNB.用100mL磷酸盐缓冲液溶解.
5分光光度法
5.1仪器设备
5.1.1分光光度计.
GB/T 26348-2010
5.1.2恒湿水浴箱.5.1.31mL玻璃组织匀浆器.5.1.4离心机（离心力10000g以上）.5.1.5加液器.
5.2操作步骤
5.2.1酶源的制备取成蚊5只做为1组，放入4C预冷的玻璃组织匀浆器中，加人0.5mL磷酸盐缓冲液（pH7.5，0.1mol/L，含0.1%TritonX-100），充分匀浆.匀浆液在4℃，5000g离心5min，取上清液作为待测酶液，冰浴保存备用.
5.2.2取6支试管，分别加人6.1.1中制备酶液0.1mL，在其中3支试管中分别加入0.1mL的杀虫 剂溶液，充分混匀，使其终浓度达到区分浓度（常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A表A.1），且丙酮终浓度小于1%.另3支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管：再取1支试管加人0.2mL磷酸盐缓冲液，作为空白对照.
5.2.3上述7支试管30℃保温5min后，分别加人0.1mL0.01mol/L乙酰硫代胆碱（ATCh），在30C继续保温 15 min后，加人3.6m1 DTNB-乙醇显色剂.
5.2.4将空白对照调至仪器显示为0点，在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值（OD）计算平均值.
5.2.5按上述方法每个种群检测100组蚊虫.
5.3结果表述
测定AChE残存活性的计算见公式（1）：
*( 1 )
式中：
E-AChE残存活性；OD药剂处理管平均光密度值ODOD-无药剂对照管平均光密度值OD:
5.4判别标准
AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的蚊虫组为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂抗性组，抗性组在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群.
6酶标仪法
6.1仪器设备
6.1.1酶标仪.6.1.31ml玻璃组织勾浆器. 6.1.2恒湿水浴箱，6.1.4离心机（离心力10000g以上）.6.1.5加液器.2
6.2操作步骤
6.2.1酶源的制备取成蚊1只，放人4C预冷的玻璃组织匀浆器中，加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐 缓冲液充分匀浆.匀浆液在4C，5000g离心5min，取上清液作为待测酶液，冰浴保存备用.
6.2.2分取0.1mL.6.2.1中制备酶液到酶标板的3个孔中，再在各孔中加人0.1mL杀虫剂溶液，杀虫剂用磷酸缓冲液稀释，使其终浓度达到区分浓度（常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见表A.1)，且丙酮的终浓度不超过1%.以0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照，加人另外3个孔 中.在30℃保温5min后，分别加入0.2mLATCh-DTNB混合溶液，在412nm测定5min时间动力学曲线，曲线的斜率作为反应初速度（）.计算平均值.
6.2.3按上述方法每个种群检测100只蚊虫.
6.3结果表述
测定AChE残存活性的计算见公式（2）：
**( 2 )
式中：
EAChE残存活性：药剂处理组平均反应初速度；一无药剂对照组平均反应初速度.
6.4判别标准
AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的蚊虫为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂抗性个体，抗性个体在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群.
