中华人民共和国国家标准
GB/T26349-2010
蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法
Testmethodsof fly resistance toinsecticides-Test methods of insensitive acetylcholinesterase for musca domestica
中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的起草规则起草.
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口，
本标准起草单位：中国农业大学、北京市疾病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所.
本标准主要起草人：高希武、曾晓其、梁沛、马彦、刘婷、佟颖、赵形言.
家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 蝇类抗药性检测方法
1范围
本标准适用于家蝇对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测. 本标准规定了家蝇（Mascadomestica）不敏感乙酰胆碱酯酶（AChE）的检测方法.
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2. 1
乙酰胆碱酯酶区分浓度discriminating concentration of acetylcholinesterase
mmol/L. 能够抑制敏感品系家蝇乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度，单位为mol/L或
2. 2
F1代F1generation
从现场捕捉的家蝇，繁殖后得到的第一代.
3试虫
-20℃条件下储存不超过1周或一80℃条件下储存6个月以内. 现场采集家蝇，室内饲养，羽化后3d~5d的F1代雌性家蝇.冰浴条件下储存不超过1d，
4试剂
4.1磷酸氢二钠（NaHPO）.化学纯.4.2磷酸二氢钾（KHPO），化学纯.4.3曲拉通X-100（Triton X-100）.4.4乙酰硫代胆碱（ATCh），分析纯. 4.55，5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB），分析纯.4.6磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH7.5PBS），称取30.18g NaHPO 12HO和2.16g KHPO 蒸馏水定容至1000ml.4.7DTNB-乙醇显色剂：称取12.4mgDTNB，溶于125mL95%乙醇中，加人50mL磷酸缓冲液，最 后用蒸馏水定容至250mL，4C避光保存.4.8ATCh溶液：称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中，-20C避光保存.
5分光光度法
5.1仪器设备
5.1.1分光光度计.
GB/T 26349-2010
5.1.2恒湿水浴箱.5.1.3玻璃组织匀浆器.5.1.4台式冷冻离心机（离心力10000g以上）. 5.1.5加液器.
5.2杀虫药剂的配制
用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，试验前用磷酸盐缓冲液（含0.1%TritonX-100）稀释到区分浓度（常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见表A.1）的2倍，溶剂 在反应体系中的最终浓度应小于1%.
5.3操作步骤
5.3.1取家蝇1只，用眼科剪刀或手术刀片将头部剪（切）下，放人4C预冷的玻璃组织匀浆器（1mL）5.3.2匀浆液在4℃，10000g离心15min，取上清液即为酶液，冰浴保存备用. 中，加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液（含0.1%TritonX-100），充分匀浆.0.1mL.使其终浓度达到区分剂量，第4支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管；另取1支试管加人0.2mL磷酸盐缓冲液作为空白对照.5.3.4上述5支试管30C保温5 min后，分别加人0.1mLATCh，在30“C继续保温15min后，加人 1.6mLDTNB-乙醇显色剂.5.3.5以空白对照调仪器0点，在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值（OD）5.3.6按上述方法每个种群检测100只家蝇.
5.4结果表述
测定AChE残存活性的计算见公式（1）：
(1)
式中：
EAChE残存活性；OD药剂处理管平均光密度值OD3OD一一无药剂对照管平均光密度值OD，
5.5判别标准
AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群.
6酶标仪法
6.1仪器设备
6.1.2恒温水浴箱. 6.1.1酶标仅，6.1.3玻璃组织匀浆器.2
6.1.4台式冷冻离心机（离心力10000g以上）.6.1.5加液器.
6.2杀虫药剂的配制
用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，试验前用磷酸盐缓冲液（含0.1%TritonX-100）稀释到区分浓度（常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见附录A表A.2）的2.5倍，溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%.
6.3操作步骤
6.3.1取家蝇1只.用眼科剪刀或手术刀片将头部剪下，放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器（1mL）中，加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液（含0.1%TritonX-100），充分匀浆
6.3.2匀浆液在4C，10000g离心15min，取上清液即为酶液，冰浴保存备用.
6.3.3在酶标板孔中加人0.1mL酶液，在每个孔中分别加人0.05mLDTNB和0.1mL含抑制剂的 ATCh溶液，抑制剂终浓度为区分浓度，每只家蝇设无抑制剂对照一个，用缓冲液代替抑制剂量，在酶标仪中读数5min，曲线的斜率作为反应初速度（v）.计算平均值.
6.3.4按上述方法每个种群检测100只家蝇.
6.4结果表述
测定AChE残存活性的计算见公式（2）：
**( 2 )
式中：
EAChE残存活性；0--药剂处理组平均反应初速度；无药剂对照组平均反应初速度.
6.5判别标准
AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群.
