中华人民共和国国家标准
GB/T26347-2010
蚊虫抗药性检测方法 生物测定法
Test methods of mosquito resistance to insecticides-Bioassay methods
中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口.
本标准起草单位：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、中国农业大学、北京疾病预防控制中心
本标准主要起草人：赵彤言、汪中明、董言德、曾晓芃、高希武、宋锋林、佟颖、韩玉华.
蚊虫抗药性检测方法生物测定法
1范围
本标准规定了测定蚊虫对有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等杀虫药剂抗药性的诊断剂量法和敏感基线法.
本标准适用于淡色库蚊（Culexpipiens pallens）、致倦库蚊（Cx.pipiens quinguefasciatus）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）、中华按蚊（Anopheles sinensis）等蚊虫抗药性的生物测定.
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1敏感基线susceptible haseline data
所测蚊虫的敏感品系对某种杀虫剂的毒力回归线（LDp).
2.2
LC），一般以2倍LC或LC值区别抗性和敏感种群. 由敏感品系的敏感基线计算得到的与死亡率99%或99.9%相对应的杀虫药剂剂量值（1C或
2.3F1 代F1generation
采集的样本繁殖后的第一代蚊虫.
3试虫
样本多点采集.幼虫浸渍法采用F1代四龄幼虫.成蚊接触简法采用野外采集的幼虫或羽化后，3d～5d未吸血雌.
4试剂
丙酮、乙醚、白油、杀虫剂原药等.
5仪器
蚊笼、滤纸、接触筒（参见附录A）、吸蚊器.
6测试条件
温度：25C士1C，光周期：14L10D，相对湿度：60%~80%.
7.1原理
作为敏感基线.以待测昆虫种群得到的杀虫剂毒力回归线与敏感基线对比，来确定待测种群的抗性水 依据杀虫剂应用剂量和死亡机率值关系建立毒力回归方程，以敏感品系得到的杀虫剂毒力回归线平.具体是比较两条毒力回归线的值变化以及由毒力回归线计算得到的半数致死量的变化.
7.2操作步骤
7.2.1幼虫浸渍法
每只烧杯量人149mL脱氯自来水.将待测药剂用丙酮等比或等差稀释至一个系列浓度，通过预实验确定药剂的浓度系列范围，最低浓度时幼虫死亡率小于20%，最高浓度时大于80%，然后吸取1mL已配制好的药液滴人水面上，用玻璃棒搅匀，然后把另一杯中预先挑选的幼虫（30只）连同50mL水全部注入烧杯内，合计200mL水溶液，整个实验保持在25℃土1C，相对湿度60%～80%的温室 内，24h后检查死亡数.每个浓度重复3次，以丙酮作为对照.根据每一浓度对应的死亡率，将剂量取对数、将死亡率转换为概率单位进行回归，求出LC值.
7.2.2成蚊接触法
用白油与乙醚按112的配比混合物将待测药剂等比或等差稀释至一个系列浓度，通过预实验确定药剂的浓度系列范围，最低浓度时幼虫死亡率小于20%，最高浓度时大于80%，取2mL每个浓度的药做为接触简，用吸蚊管吸取30只羽化后3d～5d未吸血雌，放入接触简内，关闭隔板，开始计算接触 液均匀涂抹于15.7cm×12.5cm大小的1mm厚的滤纸上，待溶剂挥发大约5h后，衬整于圆筒内壁，时间，接触1h后抽开隔板，将蚊虫吹人恢复简内，取下恢复筒，直立放置，用一浸有8%葡萄糖水的棉花团置于隔板上的小孔内，24h后记录试虫死亡数.每一个药剂浓度重复3次.以白油与乙醚的混合物作为对照，根据每一浓度对应的死亡率，将剂量取对数、将死亡率转换为概率单位进行回归，求出LC值.
7.3死亡判断
7.3.1幼虫浸渍法
轻轻触动幼虫，以不能逃避刺激视为死亡.
7.3.2成蚊接触法
试虫完全不动视为死亡.
7.4结果表述
结果用抗性倍数表述，抗性倍数=待测种群LC值/敏感种群LC值.
7.5判别标准
敏感品系和所测样本之间95%置信限不重叠，且抗性倍数≥5倍为抗性种群.
8诊断剂量法
8.1原理
量.一般用2倍敏感品系的LC值作为诊断剂量.根据待检测蚊虫种群在诊断剂量下的死亡率作为 依据条虫剂对敏感品系的毒力回归线，确定一个能够区分敏感个体和抗性个体或抗性杂合子的剂抗性判定标准.
8.2操作步骤
8.2.1幼虫浸渍法
挑选好的30条幼虫连同50mL水，全部注人上述烧杯内，合计200mL溶液，使药剂的终浓度达到诊 取1mL已配制好的药液加人盛有149mL脱氯自来水的烧杯中，用玻璃棒搅匀.把另一杯中预先断剂量（常用杀虫药剂对涉色库蚊幼虫的诊断剂量参见表B.1）.以1mL相应溶剂处理为对照组.24h后记录死亡数，实验重复3次.
8.2.2成蚊接触法
药剂用白油与乙醚混合物（配比1：2）稀释至诊断剂量浓度（常用杀虫剂对成蚊的诊断剂量参见表B.2和表B.3），取2mL药液均匀涂抹于15.7cm×12.5cm大小的1mm厚的滤纸，待溶剂挥发5h后，将滤纸衬垫于接触筒内壁，用吸蚊管吸取30只羽化后3d~5d未吸血雌蚊，放入接触简内，关闭隔板，水的棉花团置于纱网上，24h后记录试虫死亡数.实验重复3次，以白油与乙醚的混合物作为对照. 开始计算接触时间，接触1h后抽开隔板，将蚊虫吹人恢复简内，取下恢复筒，直立放置，用浸有8%葡萄糖
8.3结果表述
结果用死亡率表述，见公式（1）.
式中：
M-死亡率；
N---死亡虫数：
N试虫总数.
对照死亡率小于5%无需校正；对照死亡率在5%～20%之间，用Abbott公式进行校正；对照死亡率大于20%为无效测定.
依据Abbott公式校正死亡率，见公式（2）.
式中：
M校正死亡率；M.处理组死亡率：M.-对照组死亡率.
8.4判别标准
8能抗性种群：死亡率<80%表明其为抗性种群.
