中华人民共和国国家标准
GB/T 28062-2011
Detection of Candidatus Liberibacter asiaticus using thereal-time fluorescentPCR
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出人境检验检疫局.本标准主要起草人：殷幼平、王中康、王玉玺、高文娜、夏玉先、曹月青、彭国雄、李正国.
柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法
1范围
本标准规定了柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌（CandidatusLiberibacter asiaticus）实时荧光PCR检测的样品制备、检测操作方法及结果判定标准.
本标准适用于对芸香科和非芸香科植物翟病植株和传插媒介柑桔木虱中黄龙病亚洲韧皮杆菌的检测和病害鉴定.
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB5040柑桔苗木产地检疫规程
GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
柑桔黄龙病Citrus Huanglongbing
一种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害.主要侵染柑桔属、金柑属和积属等柑桔类植株重，由带菌种苗远距离传播，田间主要由柑桔本虱取食传插.典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化，枝椭黄化，果实畸形，种子败育，严重时可引起植株死亡.
3.2
实时荧光PCRreal-timefluorescent PCR
实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在.
扩增引物primer
人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增，
3.4
扩增模板templet
DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列.
3.5
Ct值cyele threshold value
实时荧光PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数.
9
亚洲韧皮杆菌重组质粒DNArebinantplasmid DNA
利用特异性引物扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌基因组模板，获得的亚洲韧皮杆菌特异性DNA扩
增序列，经构建重组质粒、转人大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重新提取获得的质粒DNA.用于作为柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测的阳性对照.
4柑桔黄龙病菌基本信息
学名：亚洲韧皮杆菌Candidazus Liberibacter asiaticus.病害名称：柑桔黄龙病，常用英文名：CitrusHuanglongbing.分类地位：a-航细菌亚纲、根瘤细菌目（Rhizobiales），根瘤细菌科（Rhizobiaceae），韧皮杆菌属 Liberibacter的G 细菌.是一种难培养细菌.
引起柑桔黄龙病的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为3种，即分布于非洲的柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌Candidfatus Liberibacterafricanus，分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌CandidatusLiberibaeter americanus和分布于亚洲及北美的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌 Candidatux Liberi- bacter asiaticus Jagoueix et al
相桔黄龙病菌其他信息参见附录A.
本标准规定了对亚洲韧皮杆菌的检疫鉴定方法.对来自于非洲的柑桔材料的检疫检验，可参见附录B检测柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌：对来自美洲的柑桔材料，除利用本标准检测柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌外，可参见附录C检测柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌.
5方法原理
病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加人荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结 本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法.其原理是，利用合而发出荧光被检测器实时检测（荧光染料法），或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针探针5端和3端分别标记荧光素报告基团和溶灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，TagDNA聚合酶将探针水解成单核苷酸使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实 时检测（荧光探针法），由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阔值时所经历的Cr值不同，因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量.
6实验室设置
参照GB/T19495.2.实验室应至少分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应试剂配制区和检测区：每个工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用.
7主要仪器设备和试剂
7.1仪器设备
7.1.1实时荧光PCR仪.7.1.2高速台式离心机，7.1.3生物安全柜或超净工作台，7.1.4冰箱（冷藏室4℃和冷冻室-20℃）. 7.1.5涡旋混匀仪.7.1.6紫外灭菌灯.2
7. 1. 7微量可调移液器(0. 5 μL~10 gL、10 pL~100zL. 100 yL~1 000μL) 7.1.8带滤芯Tip头.7.1.9PCR反应管（0.2mL八联管）.7.1.10微滤柱. 7.1.11高压灭菌锅.
7.2试剂
7.2.1次氯酸钠（NaCIO）.7.2.3蛋白酶K（Proteinase K). 7.2.2十二烷基硫酸钠（SDS）.7.2.4三羟甲基氨基甲烷（Tris）.7.2.5乙二胺四乙酸（EDTA）.7.2.6盐酸胍（Guanidinge HCI).7.2.8实时荧光 PCR 混合试剂（Real-time PCR Master Mix）. 7.2.7无水乙醇（ethanol).
8取样及样品处理
8.1取样用具
8.1.1样品袋：牛皮纸袋或信封（一次性使用）.8.1.3剪刀，镊子，打孔器. 8.1.2枝剪.8.1.4研钵.8.1.5塑料离心管（1.5mL）.8.1.2~8.1.5的取（制）样用工具应经121℃士2℃，15min高压燕汽灭菌.田间采样每个样品采
集后或实验室处理每个不同样品后，工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上，以避免样品间相互污染.
8.2取样方法
8.2.1实地取样
产地检疫田间实地取样参照GB5040.
8.2.2叶片样品
种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株（无症材料）10株，每株取中下部成熟叶片5片，共 疑似病树按树冠东南西北四方采集，每点取中下部成熟叶片各5片，每棵树共采集叶片20张.50片.接穗等繁殖材料按规程规定的比例抽取样品.
黄龙病病害症状及疑似症状详参见附录D.
8.2.3果实样品
幼果期采样，切取果柄和果蒂，每样品采集4份：商品鲜果每批果实随机抽取10个果实，切取果柄和果蒂.
