中华人民共和国国家标准
GB/T28064-2011
Detection and identification of broad bean stain virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：陈红运、陈青、林石明、郑耘、赵文军、李一农、廖富荣、余芳平、朱水芳、陈枝楠.
蚕豆染色病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了蚕豆染色病毒的血清学和分子检测方法.
本标准适用于蚕豆Vicia faba、小扇豆Lens clinaris、豌豆Pisam sativum和菜豆Phaseolnxvaigaris种子携带蚕豆染色病毒的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3蚕豆染色病毒基本信息
中文名：蚕豆染色病毒.
学名 :broad bean stain virus.
缩写：BBSV.
属虹豆花叶病毒科Comoviridae；虹豆花叶病毒属Comovirus.
16%）、豌豆（20%）和小扇豆（0.2%~32.4%）.BBSV易机械接种传播，并可通过甲虫传毒，豆长腺象 病株花粉可通过授粉将病毒传至健株种子：远距离通过种子传播，种传寄主有蚕豆（种传率4%～甲Apioncora.x是最主要的传毒介体.
蚕豆染色病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
主要根据BBSV的血清学特性和基因组特征进行鉴定，生物学测定为辅助鉴定手段.
5仪器、设施及试剂
5.1仪器与设施
酶联检测仪、电子天平（感量0.0001g）、定性PCR仅、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等：微量移液器（2.5μL，10zL，20gL，100gl，200gL，1000L）：酶联板、研钵等；防虫温室，
5.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂（见附录B）、RT-PCR检测试剂（见附录C）.
6检测与鉴定
6.1抽样
按照SN/T2122的规定执行.
6.2制样
选取种皮呈BBSV为害症状的可疑病粒，无可疑病粒时随机选取.用无菌水浸种16h，磁盘中放人两层吸满水的滤纸，将充分吸水的种子摆放在滤纸上，20C催芽，芽长2cm~4cm时取芽进行检测. 检测方法见6.3.
注：资源性引种时，每份资源选10粒~14粒种子插种于防虫温室或网室内，持长出4片~6片叶时挑选有病毒症状植株的叶片进行检测.
6.3检测
6.3.1酶联免疫吸附测定
双抗体夹心法见附录B.
6.3.2RT-PCR检测
称取0.1g植物组织提取总RNA，沉淀充分干燥后溶于30μLDEPC处理的去离子水中.RT-PCR检测方法见附录C.
6.3.3生物学测定
生物学测定参见附录D.
7结果判定与记录
7.1结果判定
酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阴性或者鉴别寄主反应与附录D描述不符合，判定未检出蚕豆染色病毒，
酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阳性或者鉴别寄主反应与附录D描述相符合，判定检出蚕豆染色病毒.
直接对样品进行RT-PCR检测时检测结果呈阳性即可判定检出蚕豆染色病毒.
7.2结果记录
据，RT-PCR检测应有电泳结果图片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片. 记录包括：样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等.酶联测定应有酶联板反应的原始数
8样品保存
经检验确定携带蚕豆染色病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20C或者一80C冰箱中保存，做好标记和登记工作.
附录A
（资料性附录）
蚕豆染色病毒寄主、分布及危害症状
A.1寄主范围
BBSV侵染7种豆科植物：美丽猪屎豆（Crotalaria xpectabilix）、毛羽扇豆（Laxpins hirsarus）、白花草木局（Mefilotasaba）菜豆、豌豆、终车轴草（Trifoliam incarnatam）和蚕豆.
A.2病害症状
A.2.1蚕豆
蚕豆感染BBSV后，症状分为花叶型和坏死型，花叶型表现为接种叶片上有或无局部斑，新叶均呈褪绿条纹状、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状：坏死型表现为接种叶片有或无黄化或局部斑，叶脉和茎出现坏死条纹，最后茎坏死、顶枯、全株菱瓣，种子表皮出现褐色坏死色斑.
A.2.2豌豆
豌豆感染BBSV后，症状分为花叶型、顶枯型和花叶、顶枯混合型.花叶型先在新叶出现系统褪绿点，后发展为花叶、畸形：顶枯型在茎上出现系统褐色或坏死条纹，后顶梢枯死.
A.2.3菜豆
褪绿斑而后病斑中心坏死，系统斑不但在接种叶上有坏死斑，新生叶还出现系统枯斑. 豌豆感染BBSV后，症状分为局部斑和系统斑.局部斑是在接种叶上产生局部坏死斑或先为局部
A.2.4小扁豆
25d才见新叶上出现不明显花叶.因此小扁豆不适合作繁殖寄主或鉴别寄主. 小扁豆感染BBSV后，症状不明显或很长时间才有症状反应，有些品种出现死株，有些品种接种后
A.3分布地区
突尼斯等欧洲、西亚和北非国家. 英国、法国、德国、瑞典、提克、奥地利、波兰、匈牙利、意大利、叙利亚、黎巴嫩、苏丹、摩洛哥、埃及和
