中华人民共和国国家标准
GB/T28073-2011
Detection and identification of arabis mosaic virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴媛.
南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法.本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定.
2南芥菜花叶病毒基本信息
中文名：南芥菜花叶病毒.
英文名：arabis mosaic virus.
异名：arabis mosaic nepovirus;hop netlehead virus(啤酒花尊麻病病毒）;rhubarb mosaic virus(大黄花叶病毒）;raspberry yellow dwarf virus（悬钩子黄矮病毒）；ash ring and line pattern viurs（白腊树环线状病毒）；rhabarber-mosaik-virus（大黄花叶病毒）：forsythia yellownetvirus（连翘黄网状病毒）；jasmine yellow blotch virus（茉莉黄斑病毒）.
英文缩写：ArMV.
属虹豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Neporviras.
南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A.
3方法原理
利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测鉴定.
4主要仪器设备
本标准的检测鉴定方法主要使用以下仅器设备：
微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计等和各种量程的可调移液器（1000pL、200pl、100 μl. 20 μl 10μL 2 pl)
5检测与鉴定
5.1DAS-ELISA 检测
把0.5g~1.0g样品充分研磨或在液氮中研磨，按1110比例加人样品提取缓冲液，转移到5mL离心管中，8000r/min离心5min，上清液作为DAS-ELISA的检测提取液.
样品类型相一致，具体操作过程见附录B. 设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料（如：种子或叶片）应该尽量与所检测
注：提取液在3h内使用，否期保存在4C中.
5.2RT-PCR检测
ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照. 分别提取检测样品的总RNA，然后用RT-PCR检测.用健康的植物组织作阴性对照，用感染
具体操作过程见附录C.
5.3实时荧光RT-PCR检测
阴性对照，用感染ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照. 分别提取检测样品的总RNA，反转录合成cDNA后用实时荧光PCR检测.用健康的植物组织作
具体操作过程见附录D.
5.4序列测定
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成.把测序所得到的核性大于75%则判定为ArMV序列，小于75%则判定为非ArMV序列.
注：序列比对可利用 NCBI 网站上的 BLAST 款件进行 网址为 htp:/ ncbi nlm. nih. gov/BLAST/
6结果判定与报告
6.1结果判定
当产生以下检测结果时，则判定为检出ArMV：当DAS-ELISA检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测，其中有两种方法检测结果呈阳性时，判定为检出ArMV；
当RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为ArMV序列，则判定为检出ArMV
6.2结果记录与保存
记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等，血清学检测结果保存吸光值的数据报告，RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存采集的数据，序列 测定结果保存测序报告图.
附录A
（资料性附录）
南芥菜花叶病毒简介
A.1分布
欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、甸牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士、英国、乌克兰和南斯拉夫.
亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗.
非洲：南非.
北美洲：加拿大、美国.
大洋洲：澳大利亚、新西兰.
A.2形态特征
该病毒属线虫传多面体病毒，病毒粒体为等轴对称二十面体，直径约30nm，为双分体病毒，含有两条相对分子质量分别为2.4X10和1.4×10的单链RNA.超速离心后分为T（53S），M（93S）和B（126S）三个组分.该病毒具有一个外壳蛋白，相对分子质量为54kDa.
A.3寄主范围及症状
ArMV可侵染174属215种植物.主要为害的作物有大麻（Cawmabis satia）、啤酒花（Hamalasupulas）、黄瓜（Cacamis sativas）、西葫芦（Cacarbita pepo）、莴苣（Lactuca satia）、草莓（Fragaiaαncnaxsa）、葡萄（Vitisinifera）、香石竹（Dianhas caryoph yllus）、水f仙l（Narcisss tazetta）、蓄薇 （Rosa maliflora）、草木（Melilotus saveofens）、郁金香（Tulipa gesneriana）、芹菜（Apim graveo-lens）、薄荷（Mentha sppiperita）、T香（Syringa oblata）、大互豆（Glycine max）、甜菜（Beta vulgaris）、马铃薯（Solcmum tuerosm）草（Nicotiana tabcum）、番茄（Lycopericonesclenzam）、菜豆（Phaseoaxmlgaris）亚豆（Vignaungaicxlata ）、蚕豆（Viciafaba）、防豆（Pisum sca7wam）、甜瓜（Cucumis melo）、花椰茶（Brassica oleraceaL. varbotrytis）、菠菜（Spinacia oleracea ）、胡萝卜（Daxcascarota）等.
ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突.症状随着寄主植物、病毒的分离物、裁培条件、季节和年份的不同而改变，有时候ArMV的侵染是隐症的，并不会在寄主植物上表现症状，
在鉴别寄主上产生的症状：
a）昆诺蔡（Chenopodinm quinoa）和苋色蔡（C.amaranricolor）接种叶上形成褪绿的局部斑点，然后形成系统性斑驳；b）黄瓜（C.sarivas）：接种的子叶上产生褪绿的局部斑点，以及系统性脉带或黄色斑点：c）菜豆（P.uuigaris）：产生坏死的局部枯斑、系统性坏死和畸型； d）矮牵牛（Petuiahybrida）：产生局部坏死斑点或小的坏死环和系统性环斑，以及线状斑或明脉.
