中华人民共和国国家标准
GB/T28084-2011
Detection and identification ofVerticillium dahliaeKleb.
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、河南省植保植检站、四川省植物检疫站. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准主要起草人：吴立峰、韩世平、宁红、白小东、刘辉志、李素芳、熊红利、张磊.
棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定
1范围
本标准规定了棉花黄萎病田间症状识别、抽样，棉花黄萎病菌（VerricilliumdahliaeKleb.）的分离培养、检测鉴定等方法.
本标准适用于棉花植物组织和棉籽中棉花黄菱病菌的检疫检测和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB15569农业植物调运检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
微菌核microsclerotium
棉花黄萎病菌生长过程中，由一条或数条分隔菌丝体膨大、胞壁增厚，并向各个方向芽殖形成的肉眼可见的黑色菌丝颗粒.
3. 2
选择性培养基selectivemedium
进行植物病原菌分离培养时，为促进目标菌落的形成，抑制其他非目标菌的生长，在培养基中添加不同的碳源、氮源或抑制性物质而形成的具有一定选择能力的培养基.
4原理
棉花黄萎病菌主要存在于棉花植株、棉籽、土壤、病残组织、粪肥等处，侵染棉花植株后所表现的典型症状是田间诊断的重要依据；利用选择性培养基从不同的带菌材料中分离出目标病原菌，进行形态特征鉴定.
5仪器、用具及试剂
5.1仪器、用具
天平、高压灭菌锅、培养箱、生物显微镜、移液器、镊子、解剖刀、接种棒、9cm~12cm培养Ⅲ、烧杯、载玻片、盖玻片、吸管、超净工作台等.
5.2试剂
除非另有说明，本标准仅使用分析纯试剂.
GB/T 28084-2011
5.2.1磷酸氢二钾（KHPO）.5.2.2氯化钾（KCI）.5.2.3硫酸镁（MgSO）. 5.2.4L-天门冬酰胺（CHNOHO）5.2.5乙二胺四乙酸铁钠[CHN(CHCOO）：]FeNa）.5.2.6L-i山梨糖（C HO）.5.2.7琼脂. 5.2.875%五氯硝基苯（CC1NO）.5.2.9牛胆盐5.2.10四硼酸钠（NaB O;10HO）5.2.11硫酸链霉素（CHNOS）. 5.2.12葡萄糖（CHOHO）.5.2.130.1%升汞，5.2.1470%乙醇.5.2.15马铃薯. 5.2.16灭菌水，
6症状识别
察不到可疑病株，则进行踏查，方法是每隔两行顺垄检查有无可疑病株.对检查到的可疑病株，参照附 在棉花黄萎病显症明显的花铃期和吐絮期进行2次～3次调查.每次调查时，首先目视全田，若观录A进行识别判断，确认是否是棉花黄萎病，并采集、保存病株标本，记录调查结果.现场不能确认的，整株取样带回实验室鉴定，填写附录B有害生物调查抽样记录表》.
7病原整定
7.1抽样
7.1.1棉籽抽样
需要进行室内棉花黄萎病菌检测的棉籽，按照GB15569的有关要求进行抽样，填写附录B有害生物调查抽样记录表》，送实验室检验鉴定.
7.1.2受害植株抽样
在棉花生长期间特别是棉花黄菱病发病高峰期加强田间观察发现有棉花黄萎病疑似症状的植株，整株取样送实验室检测.填写附录B有害生物调查抽样记录表》.
7.2分离和培养
7.2.1制样
7.2.1.1棉籽
将送检的每个棉籽样品分为2份，一份保存备查，一份用于检验每份样品不少于50g.
7.2.1.2植物组织
选取有疑似症状的植株材料：叶片材料取病健交界处组织，每个约0.5cm²；茎杆、叶柄材料直接切
取维管束变色部分组织，每个长约0.5cm.
7.2.2消毒与培养
7.2.2.1棉籽
2次～3次，然后用灭菌镊子将其移放到Christen选择性培养基平板上，每个平板放置5粒，每个样品 将棉籽放入70%乙醇中浸泡2s~3s，除去气泡，置于0.1%升汞液中消毒2min，用灭菌水冲洗设3个重复，置于24℃~25℃C的培养箱内3d~4d，然后放人冰箱冷处理（0℃C~5C，24h），再放回原培养箱内黑暗培养10d.
Christen选择性培养基配方及制作方法参见附录C.
7.2.2.2植物组织
将取得的植物组织置于0.1%升汞液中表面消毒1min.用灭菌水冲洗2次~3次，然后置于Chris-ten选择性培养基平板上，每个平板放置3个~5个.每个样品设3个重复，置于24℃～25℃培养箱内黑暗培养10d，
7.2.3分离纯化
检查培养10d后的平板，若出现乳白色菌落，将其转接至PDA培养基上，并在24℃～25℃黑暗培养10 d
PDA培养基配方及制作方法参见附录C.
7.2.4形态鉴定
观察微菌核的形成情况，并挑取PDA平板上的培养物进行显微镜检查，参照附录D描述的病原菌形态特征进行鉴定.
7.3结果判定
转接至PDA平板上的培养物培养10d后，在显微镜下观察其形态特征，符合附录D描述的形态特征的，确定为棉花黄萎病菌VerticilliumdahliaeKleb.，鉴定结果填人《有害生物样本鉴定报告）（参见
8标本及资料保存
检测鉴定完成后，样品和分离物需作为标本保存的，制成标本并妥善保存1年.其余用于检测的样品应集中销毁，用具应进行灭活处理.检测鉴定过程及有关数据、表格要进行详细记录并归档保存.
