中华人民共和国国家标准
GB/T28099-2011
Detection and identification of Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Fang et al.)Swings et al.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、南京农业大学.
本标准主要起草人：易建平、林石明、周国梁、粟寒、印丽萍、孔德英、许志刚、胡白石.
水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了水稻细菌性条斑病菌的检测和鉴定方法.本标准适用于水稻种子及植株上水稻细菌性条斑病菌的检测与鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T0800.1进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3水稻细菌性条斑病菌基本信息
中文名：水稻细菌性条斑病菌（稻黄单胞菌稻生致病变种）.
学名 :Xathomonas oryzae pv. oryzicola(Fang et al. 1956)Swings et al. 1990 简称 Xoc.
异名：Xaxthomonas cam pestris pv. oryzicola(Fang et al. 1956） Dye 1978;Xanthomonasoryzicofa (Fang et al. 1956 ) Dowson 1943; Xaazhowonas translacens f. sp. oryzicola (Fang et al. 1956) Bradbury 1971.
病害英文名：bacterial leaf streak of rice.
属细菌界 Bacteria，变形细菌门 Proteobacteria，Y-变形细菌纲 Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属Xanzhomonax（Dowson，1939）.
病菌主要在病种子和病草上越冬，其次在水稻再生苗或李氏禾等杂草上越冬.病菌主要借雨水、流水等传播带菌种子是远距离传播的主要途径之一：
水稻细菌性条斑病菌的其他信息参见附录A.
4方法原理
根据症状特征、菌落形态特征、生理生化特征、PCR反应和致病性测试结果等进行检测鉴定.
5主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.
三甲基溴化胺（CTAB）、三氯甲烷、异戊醇、乙醇、蛋白酶、溴化乙锭、酵母粉、琼脂、蛋白陈、牛肉浸膏、营 三羟甲基胺基甲烷盐酸盐（Tris-HCI)、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基养肉汤、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸钠.
培养基和试剂配方见附录B.
6仅器用具
超净工作台、高压灭菌锅、生物显微镜、培养箱、电子天平、冰箱、离心机、水浴锅、培养Ⅲ、三角瓶、剪刀、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管.
7检测与鉴定
7.1现场检疫
按照SN/T2122和SN/T0800.1规定的程序进行现场检疫并抽取样品.
7.2实验室检测
7.2.1有症叶片的分离
后用无菌剪刀剪碎，置于无菌载玻片上，加一滴无菌水，不加盖玻片，置于显微镜下观察喷菌现象，如观察到喷菌现象，从喷菌处用接种环取一环处理液在NA（PSA或NBY）培养基平板上划线分离，重复3个 平板，27℃培养3d~5d
7.2.2无症叶片的分离
取10张无症叶片，剪碎研磨后提取DNA，进行PCR检测，DNA提取程序和PCR检测程序见附录C.阳性样品进行病菌分离，另取无症叶片10张，无菌水冲洗叶面，70%酒精表面消毒15s，无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，加人适量无菌水，静置15min，用接种环取处理液在NA（PSA或NBY）培养 基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d~5d.
7.2.3从种子中分离
Tween20的无菌水中4C过夜，取100xL处理液在PSA培养基平板上涂布，重复3个平板，27C培养 种子处理液在培养基上富集后进行PCR检测，100g种子磨碎后置于200mL含有0.01%1mL在无菌水中系列稀释三次，分别取稀释和未稀释的处理液100uL在NA（PSA或NBY）培养基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d~5d.
7.3鉴定方法
7.3.1形态特征鉴定
培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，粘液状：PSA培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽.挑取可疑菌 NA培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整：初始为白色后变为浅黄色：NBY落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定.
7.3.2生理生化鉴定
病菌能使明胶液化，使石蕊牛乳陈化，使阿拉伯糖产酸；不还原硝酸盐产生氨和硫化氢：不产生吲用BIOLOG微生物自动鉴定系统进行鉴定.
7.3.3PCR方法鉴定
制备分离物10CFU/mL.细菌悬浮液，1mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测程序见附
7.4致病性测试
三种鉴定方法之一为阳性的分离物进行致病性测试.30d~45d龄期大小的1R24或汕优63种植10CFU/mL细菌悬浮液，无菌接种针取菌液后针刺接种于叶片中部，每张叶片针刺两个点，共接种 在12h光照/黑暗的循环条件下，最适温度为28℃~32℃/22C（白天/夜晚）.用无菌生理盐水配制30张~40张叶片.接种植株用塑料袋保湿24h，12h光照/黑暗的循环条件下30℃培养，接种48h~72h后观察症状，最长至14d.初始症状为接种点出现红色条斑，通常10d后显症，病斑边缘为线条形，沿叶脉扩展.如果产生典型症状，从接种病斑上再次分离病菌，培养基上形态特征相符或PCR检测为阳性即可认为接种分离物为水稻细菌性条斑病菌.
8结果判定
性分离物进行致病性测试，出现典型症状，判定为检测出Xoc；其余情况判定为未检出Xoc. 从样品中分离得到的可疑分离物用形态特征，生理生化或PCR检测等三种方法之一进行鉴定：阳
9样品保存
理；分离菌株应妥善保存，将菌株转接到NA试管斜面上，28C培养48h.然后置于4C冰箱中保存，定 阳性种子样品至少保存6个月，至少1000粒，以备复核、谈判和仲裁：阳性的植物材料及时销毁处期（30d）转接；或在菌悬液中加人15%～30%甘油于一80℃下保存；必要时可将菌株冻干，-80C下长期保存.
