中华人民共和国国家标准
GB/T28100-2011
Detection andidentification of Burkholderia caryophylli(Burkholder)Yabuuchi et al.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口，
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：邵秀玲、王有福、赵文军、甘琴华、厉艳、王英超、尼秀媚、栗智平、吴兴海、张治宇、余冬冬.
香石竹细菌性萎病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了香石竹细菌性菱薄病菌的检疫鉴定方法，本标准适用于石竹属、满天星等植物种苗及产品中香石竹细菌性萎病菌的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
SN/T1157进出境植物苗木检疫规程
3香石竹细菌性萎瓣病菌基本信息
中文名：香石竹细菌性萎蒿病菌.
学名 ;Barkholderia caryoph y/li (Burkholder 1942) Yabuuchi et al. 1993Pseudomonas caryoph ylli (Burkholder 1942)Starr &. Burkholder 1942
中文俗名：麝香石竹伯克霍尔德氏菌、石竹伯克霍尔德氏菌、红掌细菌性叶疫病
病害英文名：bacterial wilt of carnation.
omonadales）假单胞菌科（Pseudomonadaceae）伯克霍尔德氏菌属（Barkholderia）. 属原核生物界（Procaryotae）薄璧细菌门（Gracilicutes）暗细菌纲（Scotophobia）假单胞菌目（Pseud-
通过感染病菌的切割部分进行短距离传播.
香石竹细菌性萎病菌基他信息参见附录A.
4方法原理
经现场查验，实验室用显微镜、定量PCR仪等仪器设备对样品进行检测，根据病原菌的菌落特征.菌体形态、生理生化特性及致病性测定和分子生物学检测结果进行判定.
5位器设备和用具
5.1仪器设备
台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机（12000r/min）、小型离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温冰箱、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、电动搅拌器、真空冷冻干燥机等.
5.2用具
培养Ⅲ试管、可调式微量进样器（2μL、10μL、20μL、100μL、200pL、1000μL）及其枪头、研钵、
GB/T 28100-2011
离心管（1.5mL、1.0mL)、PCR管（0.2pL）、量筒、烧杯等.
6试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.培养、鉴定香石竹细菌性萎病菌所用培养基参见附录B.
7检测整定
7.1现场检疫
7.1.1样品数量
按 SN/T1157的规定执行.
7.1.2症状观察
该菌侵染植株后，可在导管周围产生大量堵塞导管的赘生物，随之导致维管束变色，茎基部节间开裂溃疡，切开病茎可见有棕黄色软泥状菌液溢出：感染病菌的植物叶片和茎呈灰绿色，叶片逐渐变黄枯菱：严重者根茎部腐烂，直至植株枯菱死亡.症状显示后，植株一般会在1个～2个月内死亡，通过检查成熟植株地上部分呈现出灰绿色症状很容易进行判断.
7.2实验室检测鉴定
注：实验室检测整定流程图参见附录C.
7.2.1样品初筛
通过肉眼或显微镜观察，对危害症状不明显的潜在感染可直接通过分子生物学检测进行样品初筛，初筛阳性的样品需完成7.2.2~7.2.6的检测.
危害症状明显的样品需进行7.2.2~7.2.7的检测，30C以上的培养条件可提高症状出现的速度.
7.2.2病原菌的分离与培养
取可疑植物组织，75%酒精消毒，无菌水洗3次后，放在无菌的载玻片上用无菌的玻璃棒研碎，滴一滴无菌水于研碎的病组织上.静置2min~5min后，用稀释法或无菌的移植环取以上组织液在培养基平板上划线，28C培养24h~48h后观察菌落生长情况.
7.2.3菌落特征
病原菌在523培养基上呈圆形凸起，边缘整齐，透明，表面发亮，生长快，培养48h菌落直径2mm左右（参见附录D）；在NA培养基上生长缓慢；在KingsB培养基上，菌落黄色不透明，不产生荧光色素.如果发现可疑菌落，需进行2次～3次菌种纯化.
7.2.4形态特征
按GB/T4789.28中规定的方法进行革兰氏与鞭毛染色，显微镜观察菌体形态.
菌体杆状，少数呈丝状体，或稍弯曲的杆状，（0.35μm~0.95μm）×（1.05pm~3.18μm），菌体排列方式多样，有链状条纹、并列排列或成堆状排列等多种排列方式，具有1至数根极生鞭毛，活动性好.
7.2.5生理生化
GB/T4789.28规定的常规方法、生化管或BIOLOG微生物鉴定系统等辅助进行生理生化特性测定（见 该菌好氧，无芽孢，可氧化分解单糖、双糖、多糖，并可利用唯一的碳源和氮源，为致病菌.按表1).
表1B.caryophylli签定常用的生理生化特征表
生理生化特征 革兰氏染色 香石竹细菌性萎病菌（B.ceryophyl）接触酶氧化酶反硝化 硝酸盐还原 精氨酸双水解酶 葡萄糖氧化发酵 明胶水解淀粉水解甲基红试验最适生长温度（℃） V-P试验 28注：十；90%以上菌株为阳性；一：90%以上菌标为阴性.
7.2.6致病性测定
将纯化培养48h的菌株用无菌水配成10CFU/mL~10CFU/mL的菌悬液，用注射法接种于5叶龄~6叶龄幼嫩的香石竹根茎部，无菌水作阴性对照，标准菌株作阳性对照，30℃C～33C保湿培养48h，10d~14d左右观察病菌侵染症状.如果产生典型的症状，表明所分离的菌株具有致病性，需要从接种植株上再次分离病菌，再分离的纯菌株应具有与原菌株一致的病原特征，否则判定所分离的菌株 不具有致病性.
7.2.7PCR法检测
PCR检测实验方法见附录E.
8结果判定
8.1无症状植物
对无症状的植物体直接进行分子生物学检测进行初筛，如果检测结果为阴性，实验最终判定为阴性，如果检测结果为阳性需完成7.2.2~7.2.6的检测，进一步进行结果判定.
8.2有症状植物
对有症状的植物体需进行病菌分离，如果所分离的菌株在培养基上的菌落特征、生理生化特性与标
