中华人民共和国国家标准
GB/T28106-2011
Detection and identification of Curtobacteriumflaccumfacienspv.oortii Collins &Jones
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局.本标准主要起草人：郭京泽、魏亚东、张裕君、刘跃庭、刘鹏、罗加风、廖芳、王金成.
郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了郁金香黄色疱斑病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于栽培及其他用途的郁金香球茎、郁金香植株上郁金香黄色疱斑病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3郁金香黄色疱斑病菌基本信息
中文名：郁金香黄色疱斑病菌.
学名 ：Curtobucterium flaccamfaciens pV oorti
异名 : Corynebacteriuom flaeccwmfacienrs pv. orti Saaltink &. Maas Geesteranus 1969) Dye 8.Carlson &. Vidaver 1982 Corymrbucterium oori Saaltink &. Maas Geesteranus I969. Kemp 1977 Corynelucteriam faccumfuciens subsp. oorti ( Saaltink &. Maas Geesteranus 1969 )
病害英文名：tulip bacterial canker tulip yellow pustule.
属原核生物界Procaryotes.厚壁菌门Firmicutes，厚壁细菌纲Firmibacteria，短小杆菌属Cartobacterium
菌病叶扩散传播. 该病菌随带病球茎调运远距离传播，带病球茎通过无性繁育将该病菌传播给子球.植株间通过带
郁金香黄色疱斑病菌其他信息参见附录A.
4方法原理
从病部样品中分离病菌并纯化，然后通过革兰氏染色、生理生化测定进行该病原细菌的鉴定.郁金香黄色疱斑病菌的寄主范围、病害症状特征、生物学特性、生理生化特性（参见附录A和附录B）是该病菌的检疫鉴定依据.
5仪器、设备
生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、恒湿培养箱、八道移液器，BIOLOG细菌自动鉴定系统.
6试剂和培养基
无水乙醇、微量发酵管、革兰氏染色液.
GB/T 28106-2011
523培养基：蛋白陈8g，酵母粉4g，硫酸镁（MgSO7HO）0.3g，蔗糖（CHO）10g，磷酸氢二钾（K;HPO，)2 g，琼脂18g，水（H：O)1 000mL.调整pH值至7.0~7.1.121℃湿热灭菌20min.BUG培养基.
7对照菌株
已知标准菌株作阳性对照菌.选用本属不同种的菌株作为阴性对照菌.
8检测签定
8.1现场检测
按照SN/T2122的规定进行检疫并抽取样品.
白色斑，在球茎储藏后期病斑隆起变黄（参见A.3），应取样带回实验室做病菌分离鉴定. 若发现郁金香病株矮化，叶片出现银灰色斑，上下表皮开裂，茎杆内部变黄，球茎最外层鳞片上出现
8.2病原菌分离
织置于灭菌的培养Ⅲ中加少量灭菌生理盐水，用玻棒碾碎，用接种环雁取悬液在523培养基平板上进行 划线分离，每个样品接种不少于3个平板.接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h~72h，检查出现的菌落情况.
8.3分离菌的纯化
观察523培养基平板上产生的菌落，有黄色、有光泽、圆形、边缘整齐、直径1mm~1.5mm的菌落为可疑菌落，
挑取单个可疑菌落，在523培养基平板上划线，接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h~72h.一般连续转接2次～3次可得到纯化的分离菌.
8.4革兰氏染色
按GB/T4789.28一2003中2.2规定的方法进行.
8.5生理生化测定
件任选下列一种方法对分离菌进行生理生化测定： 从郁金香上分离纯化的细菌经过革兰民染色测定后若分离菌为革兰氏染色阳性菌则结合实验条
一应用BIOLOG细菌自动鉴定系统对分离菌进行生理生化测定.按照B1OLOG细菌自动鉴定系统规定的操作方法进行，鉴定结果为Cartobacterium flaccumfaciens，则判定该分离菌的一应用微量发酵管对分离菌进行生理生化测定.测定结果与表B.1结果一致，则生理生化测定 BIOLOG鉴定结果为阳性；结果为阳性.否则生理生化测定结果为阴性.
9结果评定
从郁金香上进行细菌分离纯化，若分离菌经过革兰民染色为阴性菌，则判定检测结果为样品不带郁金香黄色疱斑病菌.
从郁金香上进行细菌分离纯化，分离菌经过革兰氏染色为阳性菌，BIOLOG鉴定结果为阳性，或用微量发酵管进行生理生化测定其结果为阳性则判定检验样品带有郁金香黄色疱斑病菌.否则判定检验样品不带郁金香黄色疱斑病菌.
10菌株和样品的保存
分离并鉴定为郁金香黄色疱斑病菌的菌株应转接到523培养基试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4C低温冰箱中保存，定期转接，以防止病菌死亡；必要时冻干后长期保存.
检出郁金香黄色疱斑病菌的样品至少保存6个月：保存期满后，需经灭菌处理.
