中华人民共和国国家标准
GB/T28715-2012
饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法
Determination of acidic and neutral protease activity in feed additivesSpetrophotometricmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口.
本标准起草单位：农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心（杭州）、浙江大学饲料科学研究所、武汉新华扬生物有限公司.
本标准主要起草人：王小骊、柳爱春、邹晓庭、吴琪、赵芸、朱加虹、陈小丽、周樱、谢红云.
饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法
1范围
本标准规定了饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力的测定方法.
本标准适用于饲料添加剂酸性、中性蛋白酶产品中酶活力的测定以及复合酶产品中中性蛋白酶活力的测定.
本标准定量限为500U/g（U/mL).
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
酸性、中性蛋白酶活力单位acidic and neutral protease active unit
在一定温度（40C士0.2C）和相应的pH条件下（酸性蛋白酶pH3.0，中性蛋白酶pH7.2），在1 min内水解酪蛋白产生相当于1μg酚基氨基酸（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位， 以U表示.
4原理
在碱性条件下，可将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比. 蛋白酶在一定的湿度和pH条件下，水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸），通过在680nm测定其吸光度，得到酶解产生的酚基氨基酸的量，进面计算蛋白酶活力.
5试剂和材料
除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682规定的二级水.
5.1碳酸钠溶液[c（NaCO）=0.4mol/L]
称取无水碳酸钠（Na:CO）42.4g，用水溶解并定容至1000mL
5.2三氯乙酸溶液[c（CCI-COOH）=0.4mol/L]
称取三氧乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml.
GB/T 28715-2012
5.3盐酸溶液[c（HC1)=1mol/L]
取浓盐酸85mL.加水稀释并定容至1000mL，即为1mol/1.盐酸溶液.
5.4盐酸溶液[c（HC1）=0.1mol/L]
取100mL1mol/L盐酸溶液（5.3)，定容至1000mL 即为0.1mol/1盐酸溶液.
5.5氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.5mol/L]
取氢氧化钠20g，加水稀释并定容至1000mL，即为0.5mol/L氢氧化钠溶液.
5.6福林（Folin）试剂
25.0g、水700mL、85%磷酸50mL.浓盐酸100mL.小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱 于2000mL磨口回流装置中加人钨酸钠（Na:WO2HO）100.0g、钼酸钠（NaMoO2HO）中加入硫酸锂（LiSO）50g，水50ml.和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的澳（冷却后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的澳），冷却后加水定容至1000ml.混匀、过滤.试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内.使用时，以1份福林（Folin）试剂与2份水混匀，制成稀福林（Folin）试剂.
5.7乳酸缓冲液（pH3.0，适用于酸性蛋白酶）
甲液：称取10.6g乳酸（85%~90%）.加水稀释并定容至1000mL.乙液：称取16g乳酸钠（70%），加水稀释并定容至1000mL.3 d. 使用溶液：取4份甲液，加乙液（约1份）调整pH至3.0土0.05，此溶液在4C冰箱贮存，有效期为
5.8磷酸缓冲液（pH7.2.适用于中性蛋白酶）
分别称取磷酸氢二钠（NaHPO）2.34g和磷酸二氢钠（NaHPO2HO)1.00g，用水溶解，用0.1mol/L盐酸溶液（5.4）或0.5mol/L氢氧化钠溶液（5.5），单向调整pH至7.2±0.05，并定容至 1 000mL，备用.
5.91%酪蛋白溶液
5.9.11%酸性酪蛋白溶液（pH3.0）
准确称取酪蛋白1.000g，先用约0.5mL浓乳酸湿润后，再加人乳酸缓冲液（5.7）约80mL，在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/L盐酸溶液（5.4）或0.5mol/L刻度.此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为3d. 氢氧化钠溶液（5.5），单向调整pH至3.0士0.05，并转人100mL容量瓶中，用乳酸缓冲液（5.7）定容至
5.9.21%中性酪蛋白溶液（pH7.2）
80mL，在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/L盐酸溶液（5.4） 准确称取酪蛋白1.000g，先用约0.5mL氢氧化钠溶液（5.5）湿润后，再加人磷酸缓冲液（5.8）约或0.5mol/L氢氧化钠溶液（5.5），单向调整pH至7.2土0.05，并转人100mL容量瓶中.用磷酸缓冲液（5.8）定容至刻度，其余同5.9.1.
1）标冻使用的酪蛋白由中国药品生物制品检定所提供.给出这一信息是为了给使用者提供一个相对标准，如果其他产品能有相同的效果期可以使用等效产品.
5.10L-酪氨酸标准物质
纯度≥95%.
5.11L-酪氨酸标准储备溶液
精确称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸标准物质0.1000g，用20mL1mol/L盐酸溶液（5.3）溶解后，再用蒸馏水定容至100mL，即为1mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液.
5.12L-酪氨酸标准溶液
临用前.准确吸取10.0mL1mg/mL酪氨酸标准储备溶液（5.11），用0.1mol/1盐酸溶液（5.4）定容至100ml，即得到100μg/mLL-酪氨酸标准溶液.
6位器与设备
除常用实验室仪器设备外，应有下述仪器设备：
6.1分光光度计：波长范围350nm~800nm.6.2pH计：精度为0.01pH单位.6.3分析天平：感量0.0001g和0.01g6.5秒表或定时钟. 6.4恒温振荡水浴锅（或普通水浴锅）：精度为土0.2℃.
7分析步骤
7.1标准曲线绘制
5.00mL和6.00mL于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成每毫升分别含L-酪氨酸0.0μg、 分别准确吸取100μg/mL L-酪氨酸标准溶液0.00mL、1. 00mL、2.00mL、3.00mL、4.00 mL、10. 0 μg、20. 0 μg、30. 0 μg、40. 0μg、50. O μg 和 60.0 μg 的标准工作溶液.
分别吸取 L-酪氨酸标准工作溶液1.0mL，加5.0mL碳酸钠溶液（5.1）和1.0mL稀福林（Folin）试剂（5.6），于具塞试管中（每个浓度做2个平行），混匀.
将标准管同时置于40C水浴，反应20min，取出，置于冷水中，迅速冷却至室温，用10mm比色Ⅲ，纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程.回归系数（r）在0.9978以上时，方可使用，否则应重嫩. 以空白管调仪器零点在分光光度计波长680nm处测吸光度.以L-酪氨酸含量为横坐标，以吸光度为
新配制的福林（Folin）试剂应制作新的标准曲线.
7.2试样制备
7.2.1液体酶试样的制备
根据样品酶活力大小，吸取适量的液体酶液，酸性蛋白酶试样用乳酸缓冲液（5.7)[中性蛋白酶试样则用磷酸缓冲液（5.8）稀释至酶活力约为5U/mL~20U/mL，待测.
7.2.2固体酶试样的制备
将试样粉碎或充分碾碎，过孔径为0.25mm筛.根据样品酶活大小，称取0.2g~2g样品，精确至
