中华人民共和国国家标准
GB/T28982-2012
Detection of tomato spotted wilt virus by PCR
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：于翠、杨翠云、廖富荣、易建平、邓丛良、戚龙君.
番茄斑萎病毒PCR检测方法
1范围
本标准规定了番茄斑萎病毒的RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法.
本标准适用于包括种子、苗木和无性繁殖材料的活体植物材料及传毒介体中携带的番茄斑萎病毒的检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3番茄斑萎病毒基本信息
英文名：tomato spotted wilt virus 中文名：番茄斑萎病毒缩写：TSWV分类地位：布尼亚病毒科（Bunyaviridae），番茄斑菱病毒属（Tospovirus）番茄斑萎病毒其他信息参见附录A
4方法原理
用特异性抗体修饰的磁株吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA，或直接从待测样品材料中提取植物总RNA，然后在逆转录酶的作用下合成cDNA，以cDNA为模板再通过普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行检测.分析PCR结果即可明确材料中是否含有病毒核酸成分.
5位器、用具及试剂
5.1仪器设备
PCR仪，实时荧光PCR仅，旋转孵育器，电泳仪，凝胶分析成像系统，水浴锅，高速冷冻离心机高压灭菌锅，微波炉，涡旋振荡器，电子天平（感量0.001g），超低温冰箱（一80℃）等.
5.2用具
磁力架，可调式微量移液器，无RNase吸头，无RNase离心管，PCR管，研钵等.
5.3试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂.试剂配制见附录B.番茄斑萎病毒抗体，磁珠（具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子，直径280nm，表面标记有甲苯磺酰基），
Trizol或RNA抽提试剂盒，三氯甲烷，异丙醇，无水乙醇，无RNAase水，逆转录试剂盒，PCR反应相关试剂溴化乙锭DNA相对分子质量标记（100bp～2000bp），琼脂糖等.
6抽样和样品制备
6.1症状观察
现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，TSWV为害症状描述参见附录A.
6.2抽样
尽量抽取有病毒为害症状的植物材料送检，当寄主植物无症状时，也需要抽样送检.若在抽样过程中发现蓟马，则需高度重视，植物样品和发现的蓟马装入虫样管中送实验室检测，抽样方法按SN/T2122中规定执行.
6.3样品制备
如果是种苗样品，建议在植物的不同部位采样、制样以避免病毒在植物体内分布的不均匀：将待测样品放人研钵后加入液氮研磨，取100mg用于抽提RNA；或者将待测样品在常温下研磨后加入样品抽提缓冲液，离心取上清液用于免疫磁珠分离.
7检测签定
采用RT-PCR（见附录C）、免疫磁珠RT-PCR（见附录D）和实时荧光RT-PCR（见附录E）进行病毒检测、鉴定.
8结果判定
8.1样品经RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时，判定样品不携带番茄斑萎病毒.
8.2样品经RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR检测为阳性，需要进行序列测定如果序列测定结果证实与 所检测的番茄斑萎病毒一致，则可判定携带番茄斑萎病毒.
8.3样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，也可判定样品携带番茄斑萎病毒.
9样品保存和结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核，如种子在干燥条件下保存6个月，其他繁殖材料在一20C保存，带毒介体则保存于一80C，做好登记和标记工作.
9.2结果记录
RT-PCR检测或免疫磁珠RT-PCR应有电泳结果照片及序列测定报告，实时荧光RT-PCR应有扩增曲 记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等.线图片等.
附录A
A.1生物学特性
A.1.1主要寄主
番茄斑萎病毒的寄主范围很广，可侵染70个科925种植物.主要寄主包括：番茄（Lycopersiconesclentm）椒（Capsicamannam）、苣（Lacuca satia）、碗豆（Pisum satim）烟草（NicotianIahacnm）、马铃薯（Solanum taberosam）、风梨（Ananas osas）、落花生（Arachis hypogaea）、刀互(Canavalia gladiatα）、麻(Crotalaria jancea）、大互(Glycine mar）、向日葵（Helianzhus annaxs ）、（Solaxum melongena）灰毛（Tephrosia purprea）蚕豆（Viciafaba）黑吉豆（Vigna mungo）绿互 假酸浆（Nicandraphysaloides）、浆豆（Phaseolus ugaris）、灯笼果（Physalis peraviana）、茄子（Vigna radiata）、班豆（Vignaxnguiculata ）、百日菊（Zinniaelegans）、六出花（Alstroemeriaαxrantiaca）、银莲花（Anemone cazhayensis）、早芹（Apium graveolens）、秋海案（Begonia evansiana）、arietinm）、西瓜（Citrullus lanaras）、翠菊（Calliste phas chinensis）、长春花（Carharanthus rosens ） 冬瓜（Benincasa hispida）、番木瓜（Carica papaya）、菊苣（Cichorixm intys）、鹰嘴豆（Cicer黄瓜（Cucumis sativus）、西葫芦（Cucurbita pepo）、树番茄（Cyphomandra betacea）、菜蓟（Cynarascolymus）、大丽花（Dahlia pinmata）、紫色洋桔梗（Eastomarussellianam）、橡胶树（Ficus elastica ）、薛荔（Ficas pumila）、非洲菊（Gerbera jamesonii）、辣子草（Galinsoga parvifora）、棉属（GossypimLinn）、风仙花属（【mpatiens Linn.）、家山豆（Lazh yrs satis）、羽扇豆（Lxpinspoyphyus） 辣薄荷（Menha piperita）、文心兰属（Oncidium）期螺兰属（Phalaenopsix Blume）、佛手瓜（Sechimedale）、大岩桐（Sinningia speciosa）、葡萄（Vitisvinifera）、马蹄莲（Zantedeschia aethiopica）、碧冬茄属（PetuniaJuss.）、菊花（Dendranthemamorifolium）、天竺葵（Pelargoniumhortorum）、罗勒(Ocim am basilicum)等
A.1.2野生寄主
杂草也是番茄斑萎病毒及其传毒介体重要的中间宿主，主要包括：刺苑（Amaranthas spinosus）、繁缕（Srellaria media）、蔡（Chenopodium album）、牛募（Arctium lappa）、三爷鬼针草（Bidens pilosa） 辣子草（Galinosoga parviflora）、苦苣茶（Sonchas oleraceus）、芥菜（Capsella bursa-pastoris）、草木犀（Meliltas oficinalis）、小花董葵（Mafvparviflora）、匙叶草（LimonianLarifolinm）、马齿苋（Portalaca oleraceae）、龙葵（Solanum nigrum）、早金莲（Tropaeolum majus）、马鞭草（Verbenalitoralis)等
A.1.3受影咱的植物部分
整株、叶片、果实/荚.
A.1.4危害症状
TSWV的危害症状，即使是在同一寄主植物上，也会因品种、年龄、营养状况和环境条件的不同有很大差异，该病毒在一些重要经济作物和观赏植物上产生的症状如下：
番茄上的症状：叶子呈青铜色、卷曲、出现坏死条纹和斑点，叶柄、茎和茎尖也产生黑褐色条纹.与健康植株相比，被害植物矮小，红色或黄色的番茄成熟时表皮出现暗红色和黄色块斑.坏
