中华人民共和国国家标准
GB/T29431-2012
Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Smith）Davis et al.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口，
本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、华南农业大学、中国农业大学、中华人民共和国北京出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：乐海洋、彭仁、刘琼光、罗来鑫、张建军、刘勇、冯欣、粪忠年、林友伟、张卫东、高文娜.
番茄溃疡病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了番茄溃疡病菌的检疫鉴定方法，本标准适用于番茄种子、苗木等相关茄科植物材料中番茄溃疡病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3番茄溃疡病菌基本信息
中文名：番茄溃疡病菌（密执安棒形杆菌密执安亚种）.
学名： Clavibacter michiganensis subsp. michiganeasis (Smith.1910） Davis et al. ，1984，简称Cmm).
异名 ：Corynebacterium michiganense pV michiganense (Smith) Dye &. Kemp: Cor yaebaicterimmichiganense (Smith)Jensen.
病害英文名：Bacterial canker of 1omato.
属细菌域 Bacteria、故线菌门Aetinobacteria、放线菌網Aetinobacteria、放线菌目Actinomvcetales、微杆菌科Microbacteriaceae排形杆菌属Cfavibacter.
该病原菌的远距离传播主要靠带菌种子，番茄种子内外层都可带菌.在田间和温室，该病菌由伤口、气孔和自然孔口侵人寄主组织，主要通过灌溉水、雨水、修枝剪、培养料等传播.该病菌在土壤和病残体组织中可存活2年～3年.
番茄溃疡病菌的其他基本信息参见附录A.
4方法原理
根据番茄溃疡病菌的危害状，对检疫现场或田间病害调查中发现的疑似病害症状样品进行采集并带回实验室作进一步分离鉴定，依据病原菌的培养性状、致病性反应以及分子生物学特征对种类进行 判定.
5仅器和用具
生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、光照恒湿培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平、低温冰箱、接种环、牙签、注射器、恒温水浴锅、高速冷冻离心机（12000r/min以上）、匀浆机、PCR仪、电泳装置（电泳仅和水平电泳槽）凝胶成像分析仪、微量可调加样器等.
6主要试剂
蔗糖、蛋白陈、陷蛋白水解物、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾（KHPO）、磷酸二氢钾（KHPO）、硫酸镁（MgSO7HO）、琼脂、萘啶酮酸钠、硫酸多粘菌素、放线菌酮、硼酸（HBO）、甘油、磷酸氢二钠（NaHPO）、吐温-20（Tween-20）、硫代硫酸钠（NaSO）、氯化铵（NH C1）、Trizma碱、烟酸、亚确酸钾、甘露糖、碳酸钙（CaCO，）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖（电泳用）、Tag DNA聚合酶、DNAMarker.
7检测签定方法
7.1现场检疫和抽样
番茄种植田间的病害调查或进出境番茄样品的现场检疫中，若番茄植株或果实病害症状表现与附取样方法和步骤按照SN/T2122. 录A中描述类似，取样带回实验室作进一步分离鉴定：对番茄种子可进行种植观察或样品分离鉴定.
7.2种植观察
5000粒左右，最少不低于3000粒种子，生长环境温度24℃~34℃，相对湿度大于或等于70%，种子 将待测的番茄种子种植于温室或实验室的育苗钵（内土壤或基质应灭菌）中，每份种子样品种植出苗后15d内观察幼苗发病情况.如果种植期间有发病幼苗，且表现出番茄溃疡病苗期的典型症状（参见附录A），则进一步采集可疑病株进行分离鉴定.
7.3分离培养
7.3.1种子中病原细菌的分离培养
7.3.1.1种子细菌浸提液制备
例），4℃培养过夜（最少14h），在匀浆机上至少浸7min.分离培养番茄溃疡病菌所用的缓冲液、培养 将24g种子（至少12g）样品加人灭菌袋，加种子提取缓冲液（按1g种子加4mL提取缓冲液比基配方见附录B.
7.3.1.2半选择性培养基平板分离
除去上清液，沉淀用十分之一离心体积的无菌种子提取液悬浮，并用无菌种子提取液进行10倍梯度稀释（稀释到100倍），取0.1mL每一稀释度分别涂布于D2ANX和SCM或mSCM半选择性培养基平板.同时，用无菌种子提取缓冲液制备Cmm标准菌株10倍系列稀释液，取0.1mLCmm标准菌株的每一个稀释浓度分别涂布于上述半选择性培养基平板上以保证至少一个平板菌落数在50~200个范 围内.将培养Ⅲ于26℃~28C培养，在5d、7d、10d各检查平板菌落生长情况.检查Cmm标准菌株在两种培养基上生长情况和菌落形态特征.检查待测样品培养Ⅲ中是否有Cmm可疑菌落，与Cmm标准菌株比较.记录可疑菌落和其他菌落数.
在D2ANX上培养5d~7d后，Cmm菌落黄色，黏液状，凸起.
在SCM上培养10d后，Cmm菌落灰白半透明，黏液状，最后为不规则型，中间内部有黑点（斑）.
在mSCM上培养10d后，Cmm菌落半透明米白，黏液状，最后为不规则型，中间内部带有黄色/橙色点（斑）
菌落的大小和颜色在不同样品中可能存在差异.通常Cmm的形态和颜色在SCM和mSCM会发生变化.如果存在菌落形态和颜色的变化，每批样品每个Ⅲ至少桃取5个可疑菌落在YDC培养基上做进一步纯化培养观察，在YDC上，Cmm菌落黄色，圆形，凸起，黏液状，挑取具有这些特征的菌落，做 进一步的番茄致病性测定.注意在YDC上划线过程中，若菌落未分开，其菌落形态不一定总是圆形的，如果存在这种情况，可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉（Mirabilisjalapa）接种检测，若测定为阳性，则进一步在番茄上进行致病性测定，若测定为阴性，则表明为非Cmmn细菌.
7.3.2病组织中病原细菌的分离培养
用灭菌剪刀剪取病变组织（叶片、茎秆、果实）上的病斑，在70%酒精或含有效氯7%的次氯酸钠溶液中表面消毒50s~60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养Ⅲ中，加5~10滴无菌水，用灭菌镊子和剪刀将病组织捣碎，静置5min~10min.即制成组织液.用灭菌的接种环施一环组织液，在SCM或mSCM培养基上划线，每处理重复3次，25℃～28℃下培养.Cmm在SCM或mSCM培养基上生基为好，24h~48h内就可见典型金黄色菌落，挑取典型菌落，做进一步的番茄致病性测定.如果存在与典型菌落有相似特征的可疑菌落，可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉接种检测，如果测定为阳性，则进一步在番茄上进行致病性测定如果测定为阴性则表明为非Cmm细菌.
7.4紫茉莉接种检测
供测试的菌株在YDC琼脂斜面上培养48h后，用无菌水洗下，调整悬浮液中细菌的浓度为1×10CFU/mL.用一次性注射器注射接种紫茉莉叶片，同时接种标准菌株做阳性对照，接种无菌水为阴性对照.接种后植株置于18℃C～36C环境下36h~48h，观察过敏性坏死现象.当用Cmm接种后，紫茉莉的叶片在36h~48h内就能出现典型的过敏性坏死斑.其他棒状杆菌及常见植物病原细菌 均不能引起紫茉莉产生过敏性坏死反应.
7.5番茄上致病性测定
感病番茄幼苗（如华南红宝石、佳粉10号、合作908等）在生长环境温度25℃C～32C，相对湿度>70%条件下生长到2~3片真叶（大约播种后3周~4周），用灭菌牙签蘸取YDC平板上可疑菌落，在番 茄幼苗的子叶和第一片真叶之间蒸的位置，穿刺法接种.同时接种标准菌株做阳性对照，无菌牙签取无菌水接种做阴性对照.接种后植株置于25C～32C条件至少8h光照培养，并适时浇水保持苗床土壤湿润.接种后2周～3周，观察植株的萎离症状，与阳性对照进行比较并做好相关记录.由Cmm引起的典型症状是在接种位置产生溃疡斑，变黄，边缘坏死，真叶萎蒿.
7.6分子生物学检测
在上述检测和鉴定的基础上，可通过分子生物学检测进一步确定和验证.从分离培养的细菌菌株中提取DNA（也可直接用菌液，浓度1X10CFU/mL），或从表现典型症状的病组织中提取DNA，作为DNA作为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行PCR扩增.具体检测方法见附录C. 模板，进行PCR检测和电泳分析.用Cmm标准菌株DNA作为阳性对照，用非Cmm的植物病原细菌
8结果判定
若经症状检验井分离的细菌菌株在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符，致病性测定表现典型症状，且PCR检测结果为阳性.扩增的片段大小与描述相符，则可以判定为检出Cmm.其余情况判定为未检出Cmm.
