中华人民共和国国家标准
GB/T29577-2013
Detection and identification ofDitylenchus destructor Thorne
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：江丽辉、李一农、汪万春、李芳荣、赵汗青、吕玉峰、韩晶、龙海、高文娜、边勇.
腐烂茎线虫检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了腐烂茎线虫（Dirylenchns destractor Thorne）的检疫鉴定方法.腐烂茎线虫的检疫和鉴定.
本标准适用于蔬莱和花卉的块茎、鳞茎、球茎等根茎部分，其他寄主植物种子、茎、叶及裁培介质中
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
SN/T1141-2002鳞球茎蒸线虫检疫鉴定方法SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1158进出境植物盆景检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3腐烂茎线虫基本信息
中文名：腐烂茎线虫：马铃薯腐烂茎线虫.
英文名：potato rot nematode;tuber rot nematode.
学名:Ditylenchus destractor Thorne 1945.
腐烂茎线虫隶属于线虫门Nematoda（Rudolphi.1808）Lankester.1877，侧尼腺纲Secernentea vonLinstow，1905垫刃目Tylenchida Thorne 1949粒线虫科Anguinidae Nicoll，1935（1926），蒸线虫属 Ditylenchas Filipjev 1936.
腐烂茎线虫主要通过寄主植物的块芭、鳞茎、球茎及裁培介质进行远距离传播.
腐烂蒸线虫的其他信息参见附录A.
4方法原理
采集疑似寄主植物材料进行线虫分离，用显微镜观察分离到的线虫，依据腐烂茎线虫的雌虫和雄虫的形态学特征进行形态学鉴定，双重PCR分子生物学检测方法是腐烂茎线虫的重要辅助鉴定手段.
5仪器用具
5.1仪器
生物显微镜（100×～1000×）、体视显微镜（10×~80×，具透射光源）、冰箱、电热恒温箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机（1000r/min~5000r/min）、纯水仪.
5.2用具
改进型漏斗分离器、移液器（10pL、25L100gL、1000grL)；其他用具参见SN/T 11412002中
的第3章所列的用具.
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6.1形态学鉴定用试剂
参见SN/T11412002中的第4章所列试剂.
6.2分子检测试剂
DTT、4.5%吐温20）、蛋白酶K（600mg/mL）、10×PCR缓冲液（20C保存）、25mmol/1氯化钙溶 WLB （500mmol/1L氯化钾、10 mmol/LTris-盐酸、pH8. 0、15 mmol/L氯化镁、1. 0 mmol/L液（20C保存）、dNTP（10mmol/L）、Taq酶（5U/μL，20℃C保存）、6×载样缓冲液、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、澳酚蓝载样缓冲液（6×TAE缓冲液，60%甘油，0.3%溴酚蓝；4C保存）、溴化乙锭（EB，避光保存）DNAladder marker（-20C保存）、DNA凝胶回收试剂盒（室温保存）、EcoRI酶（一20C保存）、大肠杆菌DH5α感受态细胞（一70℃保存）、质粒提取试剂盒（室温保存）.
7现场检测
7.1检查
对植物进行检查，注意植物地上部分是否有生长不良，叶色失绿、黄化，植株矮化等症状：块茎、鳞茎、球根等是否有干腐、变黑等症状.收集上述有为害症状的可疑植物材料及其夹带的介质或土壤，做 好记录，写上标签，带回实验室检验.
7.2抽样
气，适当保温，放在20℃~25℃室内待检. 应有针对性地抽取具有可疑症状的样品，分别用塑料袋装好，加贴标识：带回实验室后，打开袋口透
对于无可疑症状的样品则按要求随机抽样，具体抽样比例按照SN/T1157.SN/T1158和SN/T2122中的规定进行抽样.
8实验室检验
8.1线虫分离
采用两种方法进行分离：浅盘分离法按照SN/T11412002中B.2中对对线虫分离的要求进行，改进型漏斗法参见附录B.
8.2标本制作
见SN/T1141-2002中的附录C.
8.3显微观察、描述和测计
在显微镜下，对线虫进行形态观察、描述和测计.
8.4分子生物学检测
对形态特征观察可疑的线虫进行双重PCR分子生物学检测（见附录C）.
9形态学鉴定
9.1茎线虫属形态鉴定特征
9.1.1总则
茎线虫属的雌虫和雄虫，其尾形非常相似，呈长圆锥形到近柱形，偶尔丝状，多数c'（尾长÷肛门或泄殖腔处体宽）为4~7，寄主不形成虫癌.
9.1.2雌虫
9.1.2.1体表特征
虫体一般较纤细，略弯曲，长0.6mm~1.5mm，表皮有很细的环纹，侧区有4~6条侧线.
9.1.2.2内部特征
口针细小，多数长度为7um~11μm；中食道球有或无瓣，偶尔无明显的中食道球，峡部与后食道腺之间无蕴缩，后食道腺短或长，不覆盖、短覆盖或长覆盖肠.
9.1.2.3生殖系统特征
雌虫单生殖腺、前钟，卵巢短或长，有时仲达食道区或转折，卵母细胞一行至两行排列，子宫柱状部有四排细胞（每排四个细胞）.有后阴子宫囊，且与虫体中线垂直.
9.1.3雄虫
雄虫体表特征和消化系统特征与耀虫相似.雄虫精巢不转折，精细胞大（通常直径3μm~5μm），交合伞延伸至尾长的1/4～3/4处，从不伸达尾顶端.交合剩窄细，基部宽大，其上具特殊的突起.
9.2腐烂茎线虫形态鉴定特征
9.2.1雌虫
9.2.1.1体表特征
温热杀死固定后的虫体略呈弓形向腹弯曲，有细微的环纹体宽约1μm侧线六条，在虫体两端渐减为两条：唇区低平，略缝缩唇区框架进行程度较高侧器孔位于侧唇片.
9.2.1.2内部特征
口针长度常约为10μm~14pm，针锥常占口针长度的45%~50%；口针基部球清晰、圆形，前表面向后斜.中食道球纺锤形，肌肉发达，有瓣，食道狭部窄，神经环包围处开始膨大为榜状的食道腺体：食道腺延仲、从背面稍覆盖肠的前端一小段（偶尔缓缩）：偶然亦能见到后食道腺分枝（叉）.排泄孔位于食道腺位置：半月体刚好在排泄孔前方.
