中华人民共和国国家标准
GB/T30945-2014
Determinationoftylosininfeeds-High performance liquid chromatography
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口.本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（西安）.本标准主要起草人：张眉、贾青、李会玲、冯西辉、王均良、郭洁、李胜.
饲料中泰乐菌素的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了以高效液相色谱（HPLC）仪测定饲料中泰乐菌素的方法.
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中泰乐菌素的测定，本方法定量限为1mg/kg.
本标准不适用于添加尿素的饲料.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T14699.1何料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3原理
试样中的泰乐菌素经二氯甲烷提取后，过滤滤液经HLB小柱净化、浓缩注入高效液相色谱仪进行分离，用紫外检测器检测，外标法定量.
4试剂和材料
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂，用水符合GB/T6682中一级用水的规定.
4.1甲醇.4.3甲醇：色谱纯. 4.2乙晴：色谱纯.4.4二氯甲烷.4.5正已烷.4.7乙晴溶液（50%）：取乙腾（4.2)100mL与100mL水混合.4.9泰乐菌素标准品：纯度≥98%.4.100.005mol/L磷酸二氢铵缓冲液：准确称取0.5751g磷酸二氢铵于1000mL容量瓶中，加水溶解并定容，过0.45m滤膜.4.11淋洗液：含2%氨水5%甲醇的水溶液，吸取2mL氨水（4.6）、5mL甲醇（4.1），用水稀释至 100 mL.4.12乙酸钠缓冲液（pH=5.5，0.15mol/L）：称取12.30g无水乙酸钠于1000mL量瓶中，加900mL
4.6氨水.
4.8盐酸溶液（1mol/L)：取9mL盐酸于100mL容量瓶中.用水稀释并定容.
水，使溶解，用1mol/L的盐酸溶液（4.8）调节pH至5.5，用水定容.4.13HLB固相萃取小柱（200mg3mL).4.14泰乐菌素标准储备液：精密称定泰乐菌素标准品100mg（精确到0.01mg），于100mL容量瓶中， 加人50%乙晴（4.7）溶液使溶解，并定容，该溶液浓度为1mg/mL，置4C冰箱中保存，该溶液有效期为3个月.4.15泰乐菌素标准系列：分别吸取一定量的标准储备液（4.14）.置于10ml容量瓶中，用乙晴（4.2）稀
释、定容，配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0μg/mL的标准工作液.
5仪器设备
5.1高效液相色谱仪（配紫外检测器）. 5.2振荡器.5.3天平：精度为0.01g和0.0001g.5.4固相萃取装置.5.5超纯水处理器.5.7真空泵. 5.6氮吹仪.5.8高速离心机.5.9旋转蒸发仪.5.10真空抽滤装置. 5.110.45 ym微孔滤膜.
6试样的制备
合均匀，装人密闭容器，低温保存备用. 按GB/T14699.1采集有代表性的样品按GB/T20195进行样品制备.粉碎过0.45mm孔筛，混
7分析步骤
7.1样品处理
7.1.1提取
（4.4）于振荡器上振荡提取20min，用快速滤纸过滤，收集全部滤液于梨形瓶中，在45C下于旋转蒸发 准确称取2g~3g何料样品（精确至0.01g），置于100mL具塞三角瓶中，加人25mL二氯甲烷仪上蒸干溶剂，加0.5mL甲醇（4.1）溶解残渣，再加人pH=5.5的乙酸钠缓冲溶液（4.12）4.5mL，轻轻摇匀.将此溶液转人20mL离心管中，用少量乙酸钠缓冲溶液（4.12）冲洗形瓶，洗液合并入离心管中.在离心管中加入5mL正已烷（4.5），轻轻摇动离心管，防止乳化.于4000r/min离心5min，使分 层，弃去正已烷层，下层水相层备用.
7.1.2净化
HLB小柱固定在固相萃取装置上，依次用5mL甲醇（4.3）和5mL超纯水活化柱子，将全部水相
1) Oasis@ H1.B 周相萃取小柱是由 Waters Corperation(34 Maple street Milford MA USA)提供的产品的商品名称，给出这一信息是为了给本标准使用者提供方便，面不是标准主管部门对这一产品的认可.
层加人小柱，让溶液自然流下，分别用5mL水和5mL淋洗液（4.11）淋洗，待淋洗液全部流出，抽干HLB小柱中的液体，用5mL甲醇（4.3）洗脱，收集洗脱液于试管中，在氮气流下吹干，用1mL乙（4.2）溶解残渣，过0.45μm滤膜，上机测定.
7.2测定
7.2.1色谱条件
色诺条件如下：
a）流动相：乙晴：甲醇：0.005mol/L磷酸二氢铵（4.10）=50：35：15.b）流速：0.6mL/min. c）柱温：25℃d）检测器：紫外检测器.e）检测波长：290nm，f）色谱柱：symmetry shieldRP18²，柱长250mm，内径3.9-mm，或性能类似的色谱柱.g）进样体积：20pl.
7.2.2定量测定
分别取样品试液（7.1.2）和相应浓度的泰乐菌素标准工作液（4.15）按7.2.1的条件进行分析，以外标法做单点或多点校正，以保留时间定性，峰面积定量，泰乐菌素标准溶液的色谱图参见附录A
8结果计算及表示
8.1结果计算
试样中泰乐菌素的含量（X）以质量分数（mg/kg）表示，按式（1）计算：
式中：
P -试样溶液中泰乐菌素的峰面积：（s标准溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)：V试样定容体积，单位为毫升（mL）： Ps-标准溶液中泰乐菌素的峰面积；m-试样质量，单位为克（g).
8.2结果表示
测定结果用平行测定的算术平均值表示计算结果保留3位有效数字.
9重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于10%.
