中华人民共和国国家标准
GB/T31787-2015
Molecular detection of Carnationringspotvirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、上海市标准化研究院、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：杨翠云、于翠、魏亚东、杨瑞钰、张卫东、郭京泽、胡培龙、崔学慧.
香石竹环斑病毒分子生物学检测方法
1范围
本标准规定了香石竹环斑病毒的RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR等分子生物学检测方法.
本标准适用于植物种苗中携带的香石竹环斑病毒的检测.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
SN/T1193基因检验实验室技术要求
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3位器设备、用具和试剂
3.1仪器设备
PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80C超低温冰箱、高压灭菌钢、制冰机、微波炉、藏涡振荡器.
3.2用具
可调式微量移液器（2 μL10 μL、100μL、200μL、1000L）及相应的无 RNase 吸头、无RNase离心管、PCR管和研体等.
3.3试剂
RT-PCR试剂（见附录B），IC-RT-PCR试剂（见附录C）.
4症状观察及抽样
4.1症状观察
现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，CRSV为害症状描述参见附录A
4.2抽样
发现有病毒为害症状的植物材料直接送检；未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送实验室进行病毒检测鉴定.
5病毒检测
5.1RT-PCR方法
将送检植物样品中有疑似病毒为害症状的植物组织液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA，然后
GB/T 31787-2015
反转录获得cDNA，再进行PCR反应.具体操作步骤见附录B.
5.2免疫捕获RT-PCR方法（IC-RT-PCR）
1110的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清液作为待测样品. 将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨，并按重量和病毒抽提缓冲液
用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管，洗涤后在PCR管中加人制备的待测样品，进行免疫捕获，然后反转录获得cDNA，再进行PCR反应，具体操作步骤见附录C.
5.3实时荧光RT-PCR方法
采用5.1或者5.2方法获得cDNA，进行实时荧光PCR反应.具体操作步骤见附录D.
6防污染措施
香石竹环斑病毒分子生物学检测过程的防污染措施应符合SN/T1193的规定.制样用的研钵经过洗涤液清洗后，160C干热处理2h.
7结果判定
样品经RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时，证明样品不携带香石竹环斑病毒.
样品经RT-PCR或IC-RT-PCR检测为阳性，需要进行序列测定，如果序列测定结果证实与所检测的香石竹环斑病毒一致，可判定样品携带香石竹环斑病毒.
样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，也可判定样品携带香石竹环斑病毒.
8样品保存和结果记录
8.1样品保存
保存期满后，需经灭活处理. 经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品，应妥善保存在一80C冰箱中.并做好登记和标记工作.
8.2结果记录
记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等，RT-PCR和IC-RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析结果，实时荧光RT-PCR应有荧光曲线图 与Ct值.
附录A
香石竹环斑病毒背景资料
A.1背景资料
A.1.1香石竹环斑病毒基本信息
中文名：香石竹环斑病毒.
学名：Carnation ringspot virus .
缩写：CRSV
分类地位：番茄丛矮病毒科（Tombusviridae），香石竹环斑病毒属（Dianthoviras）.
传播途径：该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播，尚未见种传报道.
A.1.2方法原理
用特异性抗体吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA，或直接从待测样品材料中提取植物总RNA，然后在逆转录酶的作用下合成cDNA，以cDNA为模板再通过普通PCR或实时荧光PCR进行检测.分析PCR结果即可明确材料中是否含有香石竹环斑病毒的核酸成分.
A.2寄主范围
香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广，在自然条件下，CRSV主要侵染香石竹，还可侵染李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃等多种果树及果园里的杂草，如：繁缕.
在实验条件下，CRSV可侵染25科共133种植物，可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物，非系统侵染的寄主范围更广，
A.3为害症状
CRSV侵染香石竹引起叶片环斑、斑驳，导致叶和花的扭曲及畸变，严重可致叶尖坏死，当CRSV与香石竹斑驳病毒（Carnarionmotulevirus）共同侵染时症状加重.CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现.
CRSV接种如下儿种鉴别寄主可产生相应的症状，可用来作为该病毒的鉴定方法之一.
苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）和昆诺蔡（C.qrinoa）：接种叶出现局部褪绿或坏死斑，通常无系统症状.
三生烟（Nicotiangtabacum var.Samsun NN）：接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑，后期病斑连成一片，
虹豆（Vigmuunguiculatassp.Sinensis）：接种叶产生局部坏死斑，接着系统感染叶产生斑驳、坏死斑、叶片卷曲或脉缩.
美国石竹（Diathus barbarus）：接种叶产生环状病斑，接着为系统褪绿及坏死斑.
千日红（Gomphrena globosa）：接种叶产生局部坏死环斑，接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形.菜豆（Phaseolasurlgaris）：接种叶产生局部坏死斑，接着叶变白、坏死，产生不规则系统斑，坏死叶
