中华人民共和国国家标准
GB/T31790-2015
Detection and identification ofPotato spindle tuberviroid
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口，
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局.
文朝慧、张成标、吴兴海. 本标准主要起草人：张永江、刘洪义、刘忠梅、辛言言、陈慧、陈红运、马洁、吕典秋、沈建国、廖富荣、
马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法.本标准适用于可能携带有马铃薯纺锤块蒸类病毒的马铃薯组织材料的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18133马铃薯种薯SN/T2481进境马铃薯种薯检疫操作规程
3仪器设备、用具及试剂
3.1仪器设备
电子分析天平（0.001g）、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、普通PCR仪、实时荧光PCR涡旋振荡器、微波炉等. 仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4C冰箱、超净工作台、一80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、
3.2用具
可调移液器（2.5 yL、10μL、20μL、100 μL、1 000pL)、吸头、离心管（0.2mL、0.5mL、1.5mL）及研钵等.
3.3试剂
除有特殊说明外，试验用试剂均为分析纯或生化试剂.R-PAGE试剂见附录B：RT-PCR试剂见附录C：实时荧光RT-PCR试剂见附录D.
4检测方法
4.1样品制备
4.1.1脱毒苗制样：对脱毒苗要逐株制样，在无菌条件下，从脱毒苗上剪下长2cm的茎段，放于小研钵中，用于提取核酸并进行后续检测：把取样的脱毒苗放回试管中，封好管口并编号，以便根据检测结果决定取舍.
4.1.2种薯制样；在隔离种植前对种薯块茎进行症状检查，对有明显症状的薯块，直接取症状部位0.2g～0.5g用于核酸提取并进行后续检测；对于无明显症状的薯块进行隔离种植.
适宜的温度是高于20C）和至少16h的光周期.在生长期间进行严格的症状检查，症状参见附录A，在花期或接近花期时，对可疑症状的植株，每株采取植株顶部完全展开的叶片0.2g～0.5g单独制样，用于核酸提取并进行后续检测：如果没有发现可疑症状，可5株混合采样用于核酸提取并进行后续检测.
4.1.4田间植株制样：对田间生长的植株作整体观察后，对症状可疑的植株，每株采集症状叶片0.2g~0.5g单独制样，进行核酸提取并进行后续检测：如果没有发现可疑症状，则按GB/T18133的要求每5株混合采样，进行核酸提取并进行后续检测.
4.2R-PAGE测定
R-PAGE测定见附录B.
4.3RT-PCR检测
RT-PCR检测见附录C.
4.4实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RT-PCR检测见附录D.
5结果判定
样品经单一方法检测为阳性，需不同原理的检测方法确认一次，两次结果均为阳性，则判定样品携带 显症马铃薯样品经4.2、4.3及4.4中的一种方法检测为阳性，则判定样品携带PSTVd：无症马铃薯PSTVd.
6样品保存与结果记录
6.1样品保存
结果判定为阳性的样品应妥善保存，并作好登记和标记，以备复核用，保存期满后，需经灭活处理.
6.2结果记录
完整的试验记录应包括：样品的来源、种类、时间，试验检测时间、地点、方法和结果，并有试验人员的签字；种薯隔离种植的显症植株应有显症照片；R-PAGE测定应有银染色结果图片，RT-PCR检测应 有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测应有扩增曲线结果图片.
附录A
（资料性附录）
A.1背景资料
A.1.1马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息
异名 ; Potato pindle tuber virus Potato gothic virus 和l Tomato bunchy top virus 缩写：PSTVd.分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiiroidae），马铃薯纺锤块茎类病毒属（Pospiviroid）.等进行传播.
学名：Potato spindle tuber viroid .
传播途径：远距离传播主要通过国际间或地区间种薯贸易：田间可通过机械接触及被感染的农机具
A.1.2方法原理
根据PSTVd在寄主植物上的症状进行初步判定；根据其RNA自然状态和变性后的不同结构分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（return-polyacrylamide gelelectrophoresis，R-PAGE)检测：根据其基因组特征进行常规RT-PCR或实时荧光RT-PCR 检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定.
A.2寄主范围
自然寄主有马铃薯（Solamum tuberosum）、番茄（Lycoperici exclentam）、孵梨（Persea αmericana）、人参果（Solanum muricaram）曼陀罗（Datura straonium）、素馨叶白英（Solanam jasminoides）蓝花 茄（S.rantonnerii）、果酱木（Streprosolen jamesonii）和灯笼果（Physalis peruviana）.人工接种寄主有31属94种.
鉴别寄主：常用的鉴别寄主有鲁特格尔斯番茄（Lycopersicon esculentum cv.Rutgers）和蓉(Scopolia sinensis).
A.3地理分布
北美洲：美国（堪萨斯、细因、马里兰、密西根、纽约、威斯康星）、加拿大（阿尔伯特、哥伦比亚、新布伦斯维克、安大略、爱德华岛、魁北克）.
欧洲：捷克、法国、德国、匈牙利、荷兰、波兰、斯洛伐克、瑞士、土耳其、英国、苏格兰、前苏联.
南美洲：阿根廷、乌拉圭、巴西、秘鲁、古巴.
非洲：南非、尼日利亚.
亚洲：阿富汗、印度、日本、中国（河北、黑龙江、江苏）.
大洋洲：澳大利亚（新南威尔土、维多利亚）.
