中华人民共和国国家标准
GB/T31791-2015
Detection and identification of Cotton leafcurlvirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国茂名出人境检验检疫局.
朱水芳、李明福. 本标准主要起草人：张立、张永江、冯黎霞、李曼、张祥林、周雪平、郑耘、马洁、李海林、辛言言、
棉花曲叶病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了棉花曲叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法.本标准适用于可能携带棉花曲叶病毒的植物组织的检疫鉴定.
2仪器设备、用具和试剂
2.1仪器设备
电子分析天平（0.001g）、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水溶锅、酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4C冰箱、超净工作台、一80C超低温冰箱、高压灭菌钢、制冰机、涡旋振荡器、微波炉等.
2.2用具
可调移液器（2.5rL、10zL、20gL、100μL、1000gL）、吸头、离心管、Eppendorf 管（0.2mL、0.5mL、1.5 mL)和研体等.
2.3试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂.DAS-ELISA、常规PCR及实时荧光PCR检测试剂分别见附录B、附录C及附录D
3检疫鉴定方法
3.1DAS-ELISA 检测
DAS-ELISA检测见附录 B.
3.2常规PCR检测
常规PCR检测见附录C.
3.3实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测见附录D.
4结果判断
DAS-ELISA检测为阳性后，常规PCR或实时荧光 PCR 检测结果为阳性即可判断样品为CLCuV 3.1、3.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性，即可判定样品为CLCuV阳性.一般是阳性.
GB/T31791-2015
5样品保存与记录结果
5.1样品保存
结果判定为阳性的样品应妥善保存，并做好登记和标记，以备复核用，保存期满后，需经灭活处理，
5.2结果记录
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字；DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据，PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR检测需 有扩增曲线结果图片.
附录A
A.1背景资料
A.1.1棉花曲叶病毒基本信息
中文名：棉花曲叶病毒.学名：Cotton leaf curl virus.缩写：CLCuV.分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomoviras）.传播途径：烟粉虱（Bemrisiatabaci）传播及苗木嫁接传播.
A.1.2方法原理
检测：根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩 根据棉花曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）增曲线的变化进行结果判定.
A.2寄主范围
该病毒可侵染的寄主有：棉花（Gossypiumhirsatam）、烟草（Nicotianafabacam）、秋葵（Hibiscusescalentus）、番茄（Lycopersiconescalenzum）、扶桑（Hibiscusrosasinensis）、苗麻（Abutilontheophrasti）、芝麻（Sesamum indicwm）、矮牵牛（Perunia hybrida）、曼陀罗（Datura stramoniam）等.
A.3分布
该病毒现主要分布在巴基斯坦、印度、苏丹、埃及、尼日利亚、马拉维和南非.
A.4病害症状
棉花植株受侵染后，早期表现新叶卷曲、叶脉膨大，后期在叶背面的主脉上形成耳突，植株矮化，结实率下降或不结实.
A.5粒体形态
棉花曲叶病毒具有典型的双联体题粒形态，大小为18nm×30nm～20nm×30nm.
A.6基因组特征
该病毒的基因组含有2个大小相近的环状ssDNA组分，大小为2.5kb～3.0kb.
