中华人民共和国国家标准
GB/T31795-2015
Detection and identification of Tomatoblackringvirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局，
本标准主要起草人：杨翠云、于翠、郭京泽、魏亚东、邓丛良、乔艳艳、崔学慧、胡培龙、孙娟.
番茄黑环病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了番茄黑环病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR、实时荧光RT-PCR、鉴别寄主检测和免疫电镜等检疫鉴定方法.
本标准适用于植物材料，包括无性繁殖材料、种子和苗木中番茄黑环病毒的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件，
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3仪器设备、设施、用具和试剂
3.1仪器设备
酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（感量0.001g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱（一80C）、高压灭菌锅、制冰机、微波炉涡庭振荡器.
3.2设施
植物隔离检疫画.
3.3用具
心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、镊子、放大镜、磁力架等. 可调式微量移液器（2gL、10L、100L、200pL、1000L)及相应的无RNase吸头、无RNase离
3.4主要试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂.
焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Tag TBRV抗体、磁珠（具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子，直径280nm，表面标记有甲苯磺酰基）、Trizol、DNA聚合酶、DNA分子标记、澳化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等.
血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B.
4症状观察及抽样
4.1症状观察
现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，TBRV为害症状描述参见附录A.
4.2抽样
发现有病毒为害症状的植物材料直接送检；未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送实验室检疫鉴定.
5检疫鉴定
5.1双抗体夹心酶联免疫吸附方法（DAS-ELISA）
释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白 对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨，并加人抽提缓冲液按1：10（质量：体积）的比例稀对照，具体操作步骤见附录C.
5.2RT-PCR方法
录D. 将种苗、种球或种子催生长出的叶片液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA.具体操作步骤见附
5.3免疫磁珠RT-PCR方法
首先进行免疫磁珠的分离，包括：清洗磁珠、抗体包被和抗原吸附，然后RT-PCR反应.具体操作步骤见附录E.
5.4实时荧光RT-PCR方法
将种苗、种球或种子催生长出的叶片液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA，具体操作步骤见附录F.
5.5鉴别寄主测定方法
在裁种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种，对DAS-ELISA或RT-PCR检测TBRV呈阳性的样品加人适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主.当任意一种鉴别寄主 植物出现如下描述症状时，即可判定接种成功：
a）昆诺蔡（Chenopdiamqurinoa）或苋色慕（Chenopdiamamaranticolor）：接种叶出现局部褪绿斑，然后出现系统褪绿斑驳.b）黄瓜（Cucumisxativus）：接种叶出现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑，后出现系统环线脉，c）“Prince”菜豆（Phaseolaxvulgaris var.Prince）：接种叶出现局部褪绿、坏死或畸形. 畸形.d）矮牵牛（Petaniahybrida）：接种叶出现局部枯斑或坏死环斑，然后出现系统褪绿环斑、线纹或明脉.e）番杏（Tetragonia expansa）：接种叶出现细轮纹，后出现环斑. f）黄花烟（Nicotianarastica）：接种叶产生局部褪绿、坏死斑或环斑.g）白肋期（N.zabzcwm White burley）或三生烟（N.tabacum Samsun NN）：接种叶产生局部坏死环和斑点，系统斑点、环或者线条斑.h）克利夫兰烟（N.cleuelandi）：接种后接种叶产生局部环斑.
5.6免疫电镜方法
利用番茄黑环病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒粒子的形态特征，
GB/T 31795-2015
具体操作步骤按照SN/T1840规定进行.如观察到直径为28nm的球状病毒粒子大量聚集或者有被抗体修饰的现象，即可判定免疫电镜结果阳性.
6结果判定
样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带番茄黑环病毒.
样品经DAS-ELISA检测为阳性，如果RT-PCR或者免疫磁珠RT-PCR结果阳性，且序列测定结果证实与所检测的番茄黑环病毒一致：或者经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，可判定样品携带番茄 黑环病毒.
样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时，可判定样品携带番茄黑环病毒.
7样品保存与记录
7.1样品保存
经检测确定携带番茄黑环病毒的样品，应妥善保存在适合的条件下以备复核.如种子保存在干燥室温环境中；种苗、鳞球茎等样品保存在一80℃冰箱中，做好登记和标记工作.
7.2记录
样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫员的签字等.酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，免疫电镜检测需要有电镜图片，RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR检测应有电泳图及序列测定分析结果.实时荧光RT-PCR检测需要有荧光曲线图与C1值.
