中华人民共和国国家标准
GB/T31797-2015
Detection and identification of Hop latent viroid
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中国农业科学研究院植物保护研究所、石河子大学.
本标准主要起草人：郭立新、邓丛良、段维军、张祥林、李世访、姜冬梅、荣德福、刘升学.
啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定方法，
本标准适用于啤酒花（Hamnlasupulas）及其无性繁殖材料、种子、花粉上啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定，同时也适用于草（Humulusjaponicus）和异株尊麻（Urtica dioica）上啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3仅器设备、主要用具和主要试剂
3.1仪器设备
低温冰箱（一80℃C）、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌钢、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、可调移（000 000[0000
3.2主要用具
无RNase 吸头（10μL 20 yL 200pL，1 000 yL，5 000μL)、无 RNase 离心管（1.5 mL，5 mL.10mL）、研体、研棒、磁性分离架、PCR反应管（200gL）、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片.
3.3主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定，RT-PCR检测试剂见附录B：实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C；斑点杂交检测试剂见附录D.
4检测样品制备
4.1种子类
随机抽取至少50粒种子样品，进行表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养Ⅲ中，在适宜的发芽温度条件下催芽，直至长出第一对真叶（发芽时间大约一周）：或者在消毒的土壤中直接种植，直至长出第一对真叶，取适量叶片，放人洁净的研钵中，加人液氮后迅速研磨成细粉状.
4.2种苗类
量样品的叶片，放人洁净的研钵中，加液氮后迅速研磨成细粉状. 对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片，对于无症状的种苗类样品选取适
5检测与鉴定
5.1试验设计
植物组织作为阴性对照，以双蒸水代答模板作为空白对照. 每个样品设置两个平行反应.检测时以感染啤酒花潜隐类病毒的植物组织作为阳性对照，以健康
5.2普通RT-PCR方法
普通RT-PCR方法见附录B.
5.3实时荧光RT-PCR方法
实时荧光RT-PCR方法见附录C.
5.4斑点杂交方法
斑点杂交方法见附录D.
6结果判定
样品经普通RT-PCR检测为阳性，且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性，则判定为检出啤酒花潜隐类病毒.
样品经普通RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的HpLVd序列一致，则判定为检出啤酒花潜隐类病毒.
7结果记录与样品保存
7.1结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字.普通RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及Ct值，斑点杂交检测保存照片，序列测定结果保存测序报告图.
7.2样品保存与处理
存在隔离温室中，其他繁殖材料可取实验样品在一80℃冰箱内保存，对检出啤酒花潜隐类病毒的样品应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁.保存期满后，应灭活处理.
附录A
啤酒花潜隐类病毒相关资料
A.1背景资料
A.1.1啤酒花潜隐类病毒基本信息
学名：Hop latent viroid.缩写：HpLVd，分类地位：马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae）、椰子死亡类病毒属（Cocadviroid）.
A.1.2方法原理
反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR反应及斑点杂交方法是本标准制定的主要依据.
A.2寄主范围
HpLVd寄主范围较窄，仅侵染啤酒花（Hamulus upulas）、草（Humalus japonicas）和异株尊麻(Urtica dioica).
A.3病害症状
寄主受HpLVd侵染后一般不表现症状，但在英国，啤酒花Omega品种受HpLVd侵染后，出现菱黄、生长缓慢及球果较小等症状.
A.4分布地区
欧洲：比利时、提克、英国、法国、德国、旬牙利、波兰、葡萄牙、俄罗斯、西班牙、南斯拉夫.亚洲：日本、韩国、中国（新疆）.美洲：巴西、美国. 非洲：南非.大洋洲：澳大利亚.
A.5传播方式
HpLVd主要通过无性累殖材料、农事操作工具进行传插：也可通过种子（8%传毒率）、花粉传播，但传毒率很低：至今尚无昆虫介体传播的报道.
A.6基因组
HpLVd的基因组为一条环状单链RNA，长256nt，具有5个功能区，形成稳定的棒状二级结构.HpLVd通过不对称滚环模式进行复制，基因组不编码蛋白质.
