中华人民共和国国家标准
GB/T31803-2015
Detection and identification of Cotton leafcrumplevirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、浙江大学、浙江出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：张永江、雷荣、沈建国、周雪平、鲁洁、张明哲、李桂芬、朱水芳.
棉花皱叶病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了棉花皱叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法.本标准适用于可能携带棉花皱叶病毒的活体寄主植物叶片组织的检疫鉴定.
2仪器设备、用具和试剂
2.1仪器设备
电子分析天平（0.001g）、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水溶锅、酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4C冰箱、超净工作台、一80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振落器、微波炉等.
2.2用具
可调移液器（2.5μL、10μL、20yL、100μL、1000μL）、吸头、离心管、Eppendorf 管（0.2mL、0.5 ml、1.5 mL>和研磷等.
2.3试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂.DAS-ELISA、常规PCR及实时荧光PCR检测试剂分别见附录B、附录C及附录D.
3检疫鉴定方法
3.1 DAS-ELISA 检测
DAS-ELISA检测见附录B.
3.2常规PCR检测
常规PCR检测见附录C.
3.3实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测见附录D.
4结果判断
3.1、3.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性，即可判定样品为CLCrV阳性.一般是DAS-ELISA检测为阳性后，常规PCR或实时荧光PCR检测结果为阳性即可判断样品为CLCrV阳性，
GB/T31803-2015
5样品保存与记录结果
5.1样品保存
结果判定为阳性的样品应妥善保存，并做好登记和标记，以备复核用，保存期满后，需经灭活处理.
5.2结果记录
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字；DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据，PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR检测需 有扩增曲线结果图片.
附录A
棉花皱叶病毒背景资料
A.1背景资料
A.1.1棉花皱叶病毒基本信息
中文名：棉花皱叶病毒.学名：Cotton leaf crum ple virus.缩写：CLCrV.分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomoriras）. 传播途径：烟粉虱（Bemrisia tabaci）及苗木嫁接传播，机械接触、苑丝子（Chuxcnta subinclasa）、种子及花粉不传播，
A.1.2方法原理
根据棉花皱叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）增曲线的变化进行结果判定.
A.2寄主范围
包括棉属（Gosxypium）、荷麻属（Abutilon）、蜀葵属（Aihaea）、木様属（Hibixcus）、锦葵属（Mal）、栗豆树属（Castanospermum）、大豆属（Glycine）、菜豆属（Phaseolus）及巢菜属（Vicia）的一些植物.
A.3分布
该病毒主要分布在印度、墨西哥、美国、危地马拉及中东地区.
A.4病害症状
该病毒侵染棉花造成叶中脉组织增生、叶脉坏死或脉明，叶脉组织的叶肉部分偶尔出现红色小点，有时形成分散的泡斑；苞叶和花常畸形；叶柄弯曲，叶片向下卷曲并有明显的花叶.
A.5粒体形态
病毒粒体双生，无包膜，直径为17nm~20nm.二聚体长30nm～32nm.
A.6基因组特征
DNA分子，即DNA-A和 DNA-B：二者是棉花皱叶系统感染必需的.A和 B共同区（menrigon， 该病毒具有Begomovirus病毒典型的基因组，含有2条大小均为2.5kb～3.0kb的单链闭合环状CR）的序列同源性相对较低.
