中华人民共和国国家标准
GB/T33114-2016
Detection and identification of Prunus necrotic ringspot virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口，本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、福建省农业科学院.
本标准主要起草人：张永江、黄迎波、孔君、谢围雪、李桂芬、马洁、辛言言、魏梅生.
李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了李属坏死环斑病毒（Prunusnecroticringxporuirux）的检疫鉴定方法.本标准适用于可能携带李属坏死环斑病毒的植物及其产品的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964植物病毒检测规范SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范
3李属坏死环斑病毒基本信息
缩写：PNRSV李属坏死环斑病毒其他信息参见附录A
学名：Prarus necrotic ringspot virus
分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）.
4方法原理
李属坏死环斑病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据.根据PNRSV与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）；依据PNRSV的基因 组特征建立RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测方法：通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有PNRSV.
5仪器、用具及试剂
5.1仪器
电子天平（感量0.001g）高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80C）、制冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、酶标仪，
5.2用具
酶联板、可调移液器（2.5L、10L、20μL、100L、200μL、1000L）和可调移液器头、Eppendorf管、研钵、微型磨等，
5.3试剂
见附录B：RT-PCR检测试剂见附录C；实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D. 除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.DAS-ELISA试剂
6抽样和样品制备
6.1抽样
有病毒为害症状的植物材料单独抽样，PNRSV的为害症状描述参见附录A：无症状的种子、苗木及其产品抽样方法按照SN/T2122中规定执行.
6.2样品制备
样品制备参照SN/T2964和SN/T3457规定执行.
苗本及其组培苗等产品：有明显症状的，直接取有症状叶片1g单独制样，用于后续检测：无明显症
状的，可5株叶片混合采样用于后续检测.
7检测签定
7.1双抗体夹心菌联免疫吸附测定（DAS-ELISA）
行加到两个孔中.健康的植物组织作为阴性对照，感染PNRSV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓 把制备的样品上清液加入已包被PNRSV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测.每个样品平冲液作为空白对照：其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片）应尽量与检测样品相一致.具体操作见附录B
7.2RT-PCR检测
RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C.
7.3实时荧光RT-PCR检测
和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D.如采用商品化一 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行.
8结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：
首先采用DAS-ELISA进行初步筛检，若检测结果为阳性，采用RT-PCR方法进行验证，若验证结果为阳性，则判定样品携带结果为阴性，则判定样品不携带PNRSV：若进一步验证的结果为阳性，则判定样品携带 PNRSV.若验证结果为阴性，则采用实时荧光RT-PCR进行进一步验证.若进一步验证的PNRSV-一若检测结果为阴性，采用RT-PCR方法进行验证，若验证结果为阴性，则判定样品不携带
GB/T 33114-2016
PNRSV：若RT-PCR验证结果为阳性，则需要将PCR产物进行测序，序列结果相符则判定样品携带PNRSV.
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带PNRSV的样品应保存在适合的条件下以备复核.如种苗、叶片等样品保存在一80C冰箱中：做好登记和标记工作，保存期限至少1年.
9.2结果记录
记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字.DAS-ELISA检测应有酶联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片和测序结果；实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图.
