中华人民共和国国家标准
GB/T33121-2016
Detection and identification of Sclerophthora rayssiae Kenneth.Kaltin et Wahl var.zeae Payak et Renfro
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫局、中华人民共和国福清出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：王宏毅、陈定虎、黄智辉、林谷圆、郑万里、黄蓬英、方志鹏、林石明、严进.
玉米褐条霜霉病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了玉米福条霜霉病菌（Sclerophzhora rayssiae Kenneth，Kaltin et Wahl var.zeae PayaketRenfro）的形态学检疫鉴定方法，明确了样品现场采集、实验室鉴定、标本制作和样品保存等方法.
本标准适用于玉米（Zeamays）植株及其谷物中的玉米福条霜霉病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T180852000植物检疫小麦矮化屋黑穗病菌检疫鉴定方法GB/T18086-2000植物检疫烟霜霉病菌检疫鉴定方法SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T2504进出口粮谷检验检疫操作规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
孢子囊sporangium
注1：成熟后易脱落，并在囊内形成游动孢子. 孢囊梗顶端膨大，并在下方生出横隔与菌丝分开形成囊状结构的无性繁殖器官，注2：孢子囊的英文复数形式为”sporangia”.
3.2孢囊梗sporangiophore
支持孢子囊的菌丝分枝.
藏卵器和雄器oogonium&antheridium
为藏卵器；小的能产生雄配子，即为雄器. 生殖菌丝生出两个大小不同的异形配子囊，大的为雌配子囊，能在囊内形成一个雌配子（卵子），即
注1：玉米褐条霜霉病菌的藏卵器与雄器同体.
注2：藏卵器与排器的英文复数形式分别为oogonia”antheridia”.
3.4
卵孢子oospore
藏卵器中的卵子与雄器的雄配子相配合后形成.
4病原菌基本信息
中文名：玉米福条霜霉病菌，又称褐条指疫霉菌玉蜀乘变种.
英文名：Brown stripe downy mildew of corn，简称 BSDM.
学名 :Sclerophrthora rayssiae Kenneth Kaltin et Wahl var zeae Payak et Renfro 1967.
科Peronosporaceae指疫霉属 Sclerophthora Thirumalachar，Shaw &.Narasimhan，1953，福条指疫霉 分类地位：藻菌界Chromista，卵菌门Oomycota，卵菌纲Oomycetes，霜霉目Peronosporales，霜霉菌 Sclerophthora rayssiae Kenneth Koltin et Wahl 1964.
传播途径：该病菌可以由被病原菌污染过的种子，或带病植株，以及混杂于货物中的病残体作远距离传播.
玉米褐条霜霉病菌的其他信息参见附录A.
5方法原理
据.玉米褐条霜霉病菌的为害症状参见附录B和附录C，病原菌的孢子囊和卵孢子形态特征见附录D. 本标准主要以玉米褐条霜霉病菌的为害症状，病原菌的孢囊梗、孢子囊和卵孢子形态特征为鉴定依
6仪器设备和试剂
6.1仪器设备和器具
6.1.1仪器设备
件，或至少配带照相功能和镜台测微尺）体视显微镜（总放大倍数不低于50倍）、超净工作台、振荡器、 生物显微镜（配带100倍油镜且最大观察倍数不低于1000倍，配备图像采集系统和图像分析软高压灭菌锅，
6.1.2器具
（直径为150mm~200mm）.
6.2试剂和材料
6.2.1试剂
行）和0.05%苯胺蓝（棉蓝）乳酚油（配制方法按GB/T18086-2000执行）. 无菌水、75%乙醇溶液、吐温20、10%氢氧化钠、席尔氏缓冲液（配制方法按GB/T180852000执
6.2.2材料
无菌滤纸、铝箔纸、Parafilm膜、载玻片和盖玻片.
7检疫和鉴定
7.1检疫
7.1.1现场检疫
7.1.1.1植株症状检查
现场对玉米植株的检疫，要在光线充足处，仔细检查植株叶片是否带有可疑症状，参见附录B和附
录C.
7.1.1.2种子和原粮的检疫
现场对玉米种子和原粮的检疫，要在检疫的现场仔细检查种子或原粮中是否夹带有可疑症状叶片及其他病残体，参见附录B和附录C.
7.1.2抽取样品
行；对于原粮样品的扦取，主要按照SN/T2504执行. 对于植株样品的扦取，主要按照SN/T1157执行；对于种子样品的扦取，主要按照SN/T2122执
7.1.3送检
将现场检疫获取的抽取样品，连同现场发现的病残体，送实验室作进一步的室内检疫及玉米褐条霜霉病病原鉴定.
7.2实验室病原菌观察、记录
7.2.1直接镜检
对于现场送检的带有可疑症状病叶或病残体，置于体视显微镜下观察，用解剖针挑取叶片病斑背面上的霉状物，放在加有1滴约10gL席尔氏缓冲液的载玻片上，盖上盖玻片，先在显微镜下用40倍物镜观察有无病菌的孢囊梗、孢子囊，再用100倍油镜记录其形态特征，测量其大小，并拍照留存.
7.2.2保湿培养
对于未带有可疑症状的病叶或病残体，用流水充分冲洗，用75%乙醇溶液浸泡1min进行表面灭菌，无菌水冲洗3次置于灭菌的培养Ⅲ（垫有充分吸取无菌水的三层无菌滤纸）中，用Parafilm膜封口后，置于21℃培养箱中，在相对湿度100%、黑暗条件下保湿培养过夜，诱发孢子囊产生后，按7.2.1方 法镜检观察、测量和病原鉴定.
7.2.3组织透明法检验卵孢子
10%氢氧化钾溶液，煮沸5min~10min至叶组织透明，平整放人用胶头滴管加上1滴0.05%苯胺蓝 对于病斑上霉状物稀少的老病叶，用眼科手术剪刀剪成约10mm×10mm，置于小烧杯中，加适量（棉蓝）乳酚油作浮载剂的载玻片上，置于显微镜下，用40倍物镜或20倍物镜逐片观察有无卵孢子，如发现有卵孢子，用100倍油镜记录其形态特征，测量其大小，并拍照留存.
7.2.4洗涤检查
对于玉米种子和原粮，每份样品充分混匀后随机取100g置于500mL三角瓶内，加人适量蒸馏水（约150mL）浸软后，再用胶头滴管加人1滴～2滴吐温20，用铝箔纸将三角瓶口封住，用振荡器激烈振荡5min，将洗涤液经滤筛过滤到烧杯后，倒进离心管，以转速1000r/min离心5min，必要时可重复离心1次，将上层清液全部倒去最后用胶头滴管加人数滴席尔氏缓冲液至沉淀液充分混匀，再用微量可调加样器吸取15μL沉淀液置载玻片上，盖上盖玻片，按7.2.1方法镜检观察有无玉米福条霜霉病菌的 孢子囊，每份样品洗涤液至少检查20个玻片.在镜检时，如发现孢子囊干变形，将镜检玻片封固后，连同沉淀液放置于5℃的冰箱中过夜，等孢子囊形态恢复后，继续按7.2.1方法镜检观察和测量.
