中华人民共和国国家标准
GB/T 36851-2018
Detection andidentificationofXanthomonasvesicatoria
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国绥芬河出人境检验检疫局、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中国农科院生物技术研究所、中华人民共和国山东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：田茜、张箭、尤波、王溪桥、赵文军、李为民、历艳.
辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了辣椒细菌性斑点病菌的样品制备、分离培养及分子生物学等检测方法.本标准适用于可能携带辣椒细菌性斑点病菌的辣概植株及种子等样品的检疫鉴定.
2辣椒细菌性斑点病菌基本信息
中文名：辣椒细菌性斑点病菌
学名 ：Xanthomonas vesicatoriα (e.g. Doidge 1920) Vauterin et al. (1995)
异名: Xanthoones cam pestris pv. vesicatoria (Doidge) Dye Bacteriam exritiosm Gardner &.eritiesa (Gardner &. Kendrick)Bergey et al.1923 Phyfomones vesicatoria (D.)Stevens 1925 Phyto- Kendrick 1921 Bacteriam vesicatoria Doidge 1920 Bacteriam vesicatorium Doidge 1920 Phytomonasmones vesicatori (Doidge) Bergey et al. 1930 Pkytomons exitiom (G &. K.)Bergey et al. 1923 Pseudomonas exitiosa Gardner &. Kendrick 1921 Pseudomonas exitiosum (G. &. K.) 1921 catoria (Doidge)Stevens 1925 Xanthomonas a.xonopodis pv vesicaforia Xaxthomonas a.xonopodis pv. Pseudomonas gardneri Sutic 1957 Pseudomonas gardneri var.capsici Sutic 1957 Pseudomonas vesi-esicatoriα (Doidge) Vauterin et al. 1995 Xanrhomonas vesicatoria (D.)Dowson
英文名：Bacterial leaf spot of pepper
单胞菌目（Xanthomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas）. 分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），Y-变形菌纲（Gammaproteobacteria），黄
传播途径：辣椒细菌性斑点病菌主要通过带菌种子进行远距离传插，亦随受侵染的植物残体及茎杆等传播.在温室，带菌种子是唯一重要的初侵染源，但幼苗移栽也是重要的传播途径.近距离传播主要借由雨水飞溅或喷酒灌溉传播.
辣椒细菌性斑点病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
DNA序列进行分子生物学检测：根据辣椒细菌性斑点病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症 根据辣椒细菌性斑点病在寄主植物上的症状进行初步判定；根据辣椒细菌性斑点病菌的特异性状等对病原菌进行分离培养及致病性测定.
4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备及用具
PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、恒湿培养箱、制冰机、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低湿冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仅、凝胶成像系统等.
4.2主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯.选择性培养基配制方法见附录B：分子生物学检测所需试剂
见附录C和附录D.
5检疫签定方法
5.1症状检查
参照附录A中的症状描，重点检查植株的叶片及果实等部位是否具有辣椒细菌性斑点病的疑似症状.病害的典型症状是：番茄果实表面产生软本塞状斑点或疮痴，边缘水渎状，卵形或不规则，辣椒果实 上很少产生症状，但早期感染可引起落果：番茄和辣椒叶片上病痕出现不规则水渍状，初为绿色，后逐渐变成福色并坏死，详见附录A病害症状描述.注意与番茄叶斑病菌（Pseadomonasxyringaepv.to
对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机采样.
5.2样品制备
5.2.1植株样品
对于有症状样品，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象，若有溢菌现象，选取新鲜组织（叶片或果实）上的病健交界处（对于无症状样品，随机选取植物组织），在75%乙醇或含有效氯1%的次水，用灭菌镊子或剪刀将病组织捣碎，静置5min~10min，即制成组织悬浮液，用于分离培养及分子生 氯酸钠溶液中表面消毒50s~60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养Ⅲ中，加5滴～10滴无菌物学检测.
5.2.2种子样品
加人适量0.05mol/L磷酸吐温缓冲液，使种子完全浸没，轻轻摇晃20s~30s混匀，在4℃下浸泡过 对于种子样品，取2000粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）倒人无菌的三角瓶或其他容器内，夜.将浸泡液1000r/min离心1min，去沉淀，上清液10000r/min离心10min，弃上清液，取沉淀，用无菌水悬浮，制成1mL~2mL样品悬浮液，用于分离培养及分子生物学检测.
5.3分子生物学检测
5.3.1模板制备
试剂盒，按照操作说明提取样品总DNA，一20C保存备用. 对于植株或种子样品，按照5.2的方法制备成样品悬浮液后直接用商业化植物基因组DNA提取
对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97C沸水浴10min；12000r/min离心10min，取上清液，一20C保存）作为分子生物学检测的DNA模板.
根据实验室条件，可选择下列任一方法（5.3.2或5.3.3）进行检测.
5.3.2PCR凝胶电泳检测
对于种子、植株等样品，以已知带菌的辣椒种子或植物组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模拟带菌方式代替），以健康的辣椒种子或植物组织作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测.
对于纯培养菌株，以X.wesicaroria标准菌株作阳性对照，用非X.vesicaforia的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录C.
5.3.3实时荧光PCR检测
对于种子、植株等样品及纯培养菌可进行实时荧光PCR检测，具体步骤见附录D，对照设置同5.3.2.
5.4分离培养鉴定
对于叶片和果实等植株样品，按照5.2.1的方法制备成组织悬浮液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在mTMB和CKTM培养基平板上划线分离，重复3次.
对于种子样品，按照5.2.2的方法制备成样品悬浮液后，用无菌水进行10倍梯度稀释3次，各取100μL稀释液在mTMB和CKTM培养基上涂板，或直接用灭菌接种环雁取样品悬浮液在mTMB和CKTM培养基平板上划线分离，各重复3次.
Ⅲ平板置于26C~28C恒温培养箱中培养.分别于培养3d、5d、7d后进行观察.依据下述X.oesi- 同时用已知的X.cesicatoria标准菌株接种上述两种半选择性培养基作为阳性对照.将培养catoria病菌在各种选择性培养基上的菌落形态，挑选出可疑菌落在营养琼脂（NA）培养基上纯化2次～3次，随后进行分子生物学鉴定、致病性测定或Biolog鉴定.
在mTMB培养基上，X.oesicaforia菌落呈黄色、稍微黏榈、圆形、隆起.X.vesicatoria能利用吐温3d~7d后，在黄色菌落周围形成白色水晶状的晕周.有些X.vesicaforia菌株仅能形成模痫的晕 周，或仅能在菌落背面形成透明晕圈或只是透明区（不明显）.
注：白色水品状的晕圈是由于吐温被分解，钙沉积在透明区的结果.
X.oesicatoria在CKTM培养基上形成的菌落与mTMB上相似，呈黄色、稍微黏稠、圆形、隆起.3d~7d后，在黄色菌落周围，因钙结晶粉末沉积，常具有白色晕圈.有些X.oesicatoria菌株仅能形成 模糊的晕圈，或仅能在菌落背面形成透明晕阁或只是透明区（不明显）.
5.5Biolog鉴定
利用Biolog微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定.
5.6致病性测定
选择2～3真叶期、容易发病的辣椒或番茄小苗（3周～4周）进行接种.使用无菌水将纯培养的菌株配制成10*CFU/mL的细菌悬浮液.用无针头的注射器，轻轻使力，从叶背让细菌悬浮液渗透到叶片里，每个菌株接种3株~5株，以清水做对照-在27℃~32C、8h~12h交答光照，90%~100%相对湿度下培养，每天观察，并记录出现水渍病斑的时间.通常致病性的X.uesicaroria在2d~4d内形 成水渎状病斑.没有致病性的细菌在24h内则产生过敏性反应，或者根本不会产生病斑.
6结果判定
6.1植株样品
对于有典型症状的植株样品，分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出辣椒细菌性斑点病菌.无症状植株样品，分子生物学检测结果为阳性，经分离培养、致病性测定或Biolog鉴定为阳性，即判定为 检出辣椒细菌性斑点病菌.
6.2种子样品
对于种子样品，分子生物学检测为阳性，即初步判定为检出辣椒细菌性斑点病菌，若分离培养、致病性测定或Biolog鉴定为阳性，则确定种子样品检出具有活性的辣椒细菌性斑点病菌.
