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食品补充检验方法
BJS202505
调味品、豆制品、肉制品等食品中 红2G、二甲基黄、二乙基黄的测定
国家市场监督管理总局 发布
调味品、豆制品、肉制品等食品中 红2G、二甲基黄、二乙基黄的测定
1范围
谱测定方法. 本方法规定了调味品、豆制品、肉制品、水产制品中红2G、二甲基黄、二乙基黄的液相色谐-申联质
本方法适用于香辛料、固体复合调味料、半固体复合调味料、豆制品、肉制品、水产制品中红2G、二甲基黄、二乙基黄的测定.
2原理
试样中的二甲基黄、二乙基黄用乙晴超声提取，提取液经基质分散萃取填料净化，液相色诺-申联质申联质谱仪测定，外标法定量. 谱仪测定，外标法定量：试样中的红2G用氨水-乙醇溶液提取，提取液经固相萃取小柱净化，液相色谱-
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂
3.1.1无水乙醇（CHOH）.3.1.2氨水（NHOH）：含量25.0%~28.0%. 3.1.3甲醇（CHOH）.3.1.4乙晴（CHCN）：色谱纯.3.1.5乙酸铵（CHCOONH）：色谱纯.3.1.6无水硫酸镁（MgSO ）. 3.1.7氯化钠（NaCI）.3.1.8甲酸（CHOOH）：色谱纯.
3.2试剂配制
3.2.2氨水甲醇溶液：量取氨水（3.1.2）2mL，用甲醇（3.1.3）稀释至100mL 3.2.1氨水乙醇溶液：量取氨水（3.1.2）20ml，再加人无水乙醇（3.1.1）70mL，用水稀释至100ml.3.2.310mmol/1.乙酸铵溶液：称取乙酸铵（3.1.5）0.7708g，用水溶解并稀释至1000mL.3.2.450%乙酸铵乙晴溶液：量取乙酸铵溶液（3.2.3）50mL，用乙晴（3.1.4）稀释至100mL.3.2.55%甲醇水溶液：取甲醇（3.1.3）5mL，用水稀释至100mL. 3.2.610mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）：称取乙酸铵（3.1.5）0.7708g，加适量的水溶解，再加人1mL甲酸（3.1.8），用水定容至1000mL
3.3标准品
二甲基黄、二乙基黄和红2G标准品：纯度均不小于95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的
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标准品.标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见附录A.
3.4标准溶液配制
3.4.1二甲基黄标准储备液（500μg/mL）：准确称取二甲基黄标准品10mg（精确至0.01mg）置于20mL容量瓶中，用乙腾（3.1.4）溶解定容至刻度，配制成500μg/mL的标准储备液，0℃C~4℃避光保3.4.2二乙基黄标准储备液（500ug/mL）：准确称取二乙基黄标准品10mg（精确至0.01mg）置于 存，有效期6个月.20 mL容量瓶中，用乙腾（3.1.4）溶解定容至刻度，配制成500μg/mL的标准储备液，0℃C～4C避光保存，有效期6个月.3.4.3红2G标准储备液（500pg/mL)：准确称取红2G标准品 10 mg（精确至0.01mg）置于20 mL容量瓶中，用水溶解后用乙晴（3.1.4）定容至刻度，配制成500μg/mL的标准储备液，0°C~4℃避光保存，3.4.4二甲基黄和二乙基黄混合标准中间溶液；分别精密量取二甲基黄标准储备液（3.4.1）和二乙基黄 有效期6个月.标准储备液（3.4.2）各0.08mL.置于同一100mL容量瓶中，用乙晴（3.1.4）定容至刻度，混匀，制成浓度为400ng/mL的二甲基黄和二乙基黄混合标准中间溶液，0℃～4C避光保存，有效期6个月.3.4.5红2G标准中间溶液：精密量取红2G标准储备液（3.4.3）1mL，置于100mL容量瓶中，用乙（3.1.4）定容至刻度，混匀，制成浓度为5μg/mL的红2G标准中间溶液，0C～4C避光保存，有效期6个月. 3.4.6二甲基黄和二乙基黄基质标准系列工作溶液：称取空白基质2g共6份，置于50mL聚丙烯离心管中，分别精密加人二甲基黄和二乙基黄混合标准中间溶液（3.4.4）10yL 20L、40L80yL、100L和 120 pL，按5.3.1 同法操作，制成浓度为2 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL、16ng/mL、20 ng/ml 和24ng/mL的二甲基黄和二乙基黄基质标准系列工作溶液或依仪器响应情况配制适当浓度的标准系列工作液.3.4.7红2G基质标准系列工作溶液：称取空白基质2g共6份，置于50mL聚丙烯离心管中，分别精成浓度为 25 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、200ng/mL、250ng/mL 和 300 ng/mL的红 2G基质标准系列工作溶液或依仪器响应情况配制适当浓度的标准系列工作液.
3.5材料
3.5.1QuEChERS净化粉末（1g/15mL)：EMR-Lipid增强型去脂分散粉末或其他等效产品.使用前加人2mL水涡旋混匀活化.3.5.2PWAX弱阴离子固相萃取柱（150mg/6mL）或其他等效柱.使用前依次用6mL甲醇、6ml水进行活化.3.5.3微孔滤膜（PTFE）：0.22μm，有机系.
4仪器和设备
4.1液相色谱-申联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）.4.2分析天平：感量分别为0.001g和0.01mg-4.3涡旋振荡器. 4.4超声仪.2
4.6氮气浓缩仪. 4.5离心机：转速不低于10000r/min4.7组织匀浆机.
5分析步骤
5.1试样的制备和保存
5.1.1香辛料、固体复合调味料、半固体复合调味料、豆制品、肉制品和水产制品取约200g，粉碎均匀后平均分装人两个洁净容器中，密封，并标识；豆制品、肉制品和水产制品置于一18C冷冻保存，香辛料、固体复合调味料、半固体复合调味料置于室温保存.
5.1.2香辛料粉混合均匀后，平均分装人两个洁净容器中，密封，并标识置于室温保存.
5.2空白样品基质的选择和确定
选择与试样基质相同或相近的阴性样品作为空白基质.
5.3样品前处理
5.3.1二甲基黄和二乙基黄测定试样溶液的制备
提取：准确称取试样2g（精确至0.001g）置于50mL聚丙烯离心管中，加人10mL乙晴，涡旋混匀1 min 超声提取 10 min，10000r/min离心10 min，上清液转移至 20 mL容量瓶中；残渣再加人5 mL乙腾重复提取一次，上清液转移至同一容量瓶中，用乙請定容至刻度，混匀，待净化.
净化：精密吸取10mL提取液加入装有QuEChERS净化粉末（3.5.1）的离心管中，涡旋1min，3700r/min离心5min，取上清液加人装有1.5g无水硫酸镁和0.5g氧化钠的离心管中，涡旋1min，3700r/min离心5min，取上清液至氮吹管中，40℃氮气浓缩至近干，精密加人1mL50%乙酸铵乙腾溶液（3.2.4）复溶，过微孔滤膜（3.5.3）供液相色谱-申联质谱仪分析.
5.3.2红2G测定试样溶液的制备
提取：准确称取试样2g（精确至0.001g）置于50mL聚丙烯离心管中，加人氨水乙醇溶液（3.2.1）10mL，涡旋混匀1min，超声10min，10000r/min离心10min，上清液转移至20mL容量瓶中：残渣再加人5mL氨水乙醇溶液（3.2.1），重复提取一次，上清液转移至同一容量瓶中，氨水乙醇溶液（3.2.1）定容至刻度，混匀，待净化.
净化：精密吸取10mL提取液至氮吹管中，60C吹至约1mL，加人10mL5%甲醇溶液（3.2.5）溶解残渣，作为待净化液：待净化液以低于1.0mL/min的流速通过活化后的固相萃取小柱（3.5.2），依次用6mL水和6mL甲醇淋洗小柱，弃去淋洗液.用10mL氨水甲醇溶液（3.2.2）洗脱，分两次加入，收集洗脱液.40C氮气浓缩至近干，精密加人1mL50%乙酸铵乙晴溶液（3.2.4）复溶，过微孔滤膜（3.5.3），供液相色谱-申联质谱仪分析.
5.4仪器参考条件
5.4.1二甲基黄和二乙基黄色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C色谱柱（3.0mm×150mm，1.8μm），或性能相当者：b）流动相：A相为10mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），B相为乙晴： c）流速0 3mL/min;
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d）柱温：40℃；e）进样体积：2ul；f）流动相梯度洗脱程序见表1.
表1二甲基黄和二乙基黄流动相梯度洗脱程序
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0 00 15 856 50 10 907 00 15 859 00 15 85
5.4.2红2G色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C色谱柱（3.0mm×150mm，1.8pm），或性能相当者；b）流动相：A相为10mmol/L乙酸铵水溶液，B相为乙精：c)流速；0.3 mL/min; d）柱温：40℃；e）进样体积：2pl；f）流动相梯度洗脱程序见表2.
表2红2G流动相梯度洗脱程序
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0 00 85 153 00 75 255 00 71 297 00 10 908 00 10 908 10 85 1510 00 85 15
5.4.3质谱参考条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源（ESI源）：b）扫描方式：正离子模式和负离子模式；c）检测方式：多反应监测（MRM）： 二甲基黄、二乙基黄、红2G质谱参考条件见附录B.
5.5标准曲线的制作
将二甲基黄和二乙基黄基质标准系列工作溶液（3.4.6）和红2G基质标准系列工作溶液（3.4.7）分别注人液相色谱-申联质谱仪中，测定相应的峰面积，以基质标准系列工作液中各化合物的浓度为横坐标， 以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.标准溶液的色谱图见附录C，
