中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T2452-2025代替SN/T 2452-2010
绵羊痘和山羊痘检疫技术规范
Technical specification for quarantine protocol of sheep pox and goat pox
中华人民共和国海关总署发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
本文件代替SN/T2452-2010《绵羊痘和山羊痘检疫技术规范》，与SN/T2452-2010相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：
增加了“病毒分离”（见第8章）：增加了"实时荧光PCR检测”（见第10章）；增加了“PCR检测”（见第11章）：增加了“酶联免疫吸附试验”（见第14章）； 一更改了“电镜观察”（见第9章，2010年版的5.1）；更改了“病毒中和试验”（见第12章，2010年版的5.4）；一更改了“综合判定”（见第15章，2010年版的第6章）；一剩除了包涵体检查（见2010年版的5.2）；删除了Western blot分析（见2010年版的5.5）.
本文件参考了世界动物卫生组织（WOAH）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2024）3.8.11章，病毒分离、电镜观察、病毒中和试验与WOAH推荐的方法一致.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任，
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口.
本文件起草单位：中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国呼和浩特海关、中华人民共和国标法中心、深圳澳东生物技术有限公司、重庆医科大学.
本文件主要起草人：史梅梅、王海艳、聂福平、王昱、季新成、杨俊、谢晓倩、李贤良、张利、赵治国、黄道超、陈林军.
绵羊痘和山羊痘检疫技术规范
1范围
本文件规定了绵羊痘和山羊痘的临床诊断、样品采集及处理、病毒分离、电镜观察、聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光聚合酶链式反应（实时荧光PCR）、病毒中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验 的技术要求，
本文件适用于绵羊痘和山羊痘的诊断、检测、监测和流行病学调查.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求GB/T45105绵羊痘和山羊痘诊断技术
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.CaPV;羊痘病毒（Capripoxvirus)CPE：细胞病变效应（Cytopathic Effect)GTPV;山羊痘病毒（Goat Pox Virus) MDBK;牛肾细胞(Madin-Darby Bovine Kidney cells)MEM:MEM 培养基(Modified Eagle's Medium)SPPV：绵羊痘病毒（SheepPoxVirus)Vero：非洲绿肾细胞(African green monkey kidney cells) TCID50：半数组织培养感染剂量（Median Tissue Culture Infective Dose)
5实验室生物安全要求
样品制备、检测过程的生物安全措施应按照GB19489中生物安全二级的有关规定执行.
SN/T 2452-2025
6临床诊断
6.1临床症状
见附录A.
6.2结果判定
根据易感动物出现绵羊痘和山羊痘的临床症状，参照附录A，可初步判定为疑似羊痘病毒感染.对病羊和可疑病羊需采集动物的病变组织或血液，进行实验室检测作出确诊.
7样品菜集
7.1器材
手术剪刀和镊子、样品保存管、离心管、注射器、样品保存袋、防水标签、防护服、组织匀浆器等.
7.2试剂
7.2.2细胞维持液（MEM培养基，含有抗生素和2%胎牛血清）. 7.2.1PBS（pH7.4)，配制方法见附录B中B.9.
7.3样品采集与处理
7.3.1样品采集类型
用于病毒分离和抗原检测的病料宜活检或剖检取皮肤丘疹、肺部病变组织或淋巴结等.用于病毒分离的样本宜在临床症状出现的一周内（中和抗体出现之前）采集.在病毒血症阶段（在病变泛化之前 或泛化后4d内）采集的EDTA抗凝血中收集到的血沉棕黄层，也可用于病毒分离.
7.3.2组织样品
采集皮肤丘疹、病羊的内脏、淋巴组织等组织病料，在实验室生物安全柜内取出待检样品，取适量样品，使用研体或其他等效研磨方法充分研磨.加入5倍体积的PBS，制备成组织匀浆液.离心取上清液 待检.
若需进行病毒分离，则取匀浆反复冻融3次，离心取上清液，用0.45um的滤器过滤，收集滤液备用.
动物源性产品参照组织样品处理.
7.3.3血液样品
用于病毒分离的血液样本应采用抗凝管收集，立即置于冰上，并尽快进行下一步处理.取抗凝血，约600g离心10min，无菌吸管小心吸取棕黄层移入5ml预冷双蒸水中，30s后，加人5mL预冷的MEM培养基（2×），约600g离心15min，弃上清液，用5mL细胞维持液重悬，用于病毒培养.
用于抗体检测的样品，全血室温静置2h以上，自然凝固后，约4000r/min离心5min，吸出血清待检，
7.3.4羊毛类样品
2 取适量待检样品，加人PBS至完全浸没样品，反复挤压后吸取悬液200gL于1.5mL无菌离心管
中待检.
或取适量待检样品，加入足量PBS充分振荡混匀：推荐可采用浓缩仪将悬液浓缩至200L~1000pL；取浓缩液200L于1.5mL无菌离心管中待检.
7.3.5其他类型样品
采集的其他类型样本（如睡液、口腔/鼻腔拭子、排泄物、环境样品等），放人含采样液的样品保存管.取待检样品，充分振荡混匀（拭子样品挤压干后弃去拭子），离心取上清液待检.
7.4样品的送检与保存
相关要求. 样本采集后应编号标记，置于样品冷藏箱送至实验室.样品的运送与保存应满足GB/T18088的
用于病毒分离的血液样品应存放于2℃～8C不超过2d，不应冷冻：用于病毒分离、核酸检测的组织或皮肤结痴最好置于冷藏或冷冻条件：若需要长期保存，宜放置于约-70C或以下.
8病毒分离
8.1主要仪器和设备
8.1.1倒置显微镜.8.1.2生物安全柜.8.1.3CO:恒温培养箱（37C土2C）. 8.1.4离心机.
8.2材料
Vero细胞或MDBK细胞或原代羔羊肾细胞等易感细胞、胎牛血清、细胞培养瓶、细胞生长液（MEM培养基，含有抗生素和10%胎牛血清）、细胞维持液（MEM培养基，含有抗生素和2%胎牛血 清）等.
8.3方法
8.3.1接种
在25cm²细胞培养瓶或培养Ⅲ中培养易感细胞，待细胞形成约90%单层后，接种1mL病料上清液或棕黄层细胞悬浮液，置37℃吸附1h后，补充10mL细胞维持液置37℃C、5%（体积分数）CO：条 件下培养.同时，设立正常细胞对照1瓶.
8.3.2培养及观察
每日观察细胞培养物是否出现CPE，持续培养7d～14d，在培养期间可适时更换细胞维持液.如果7d仍未见CPE，将细胞培养物反复冻融3次，取上清液继续接种新鲜易感细胞，一旦出现CPE，可进 行进一步检查.
8.4判定
CaPV感染易感细胞的特征性CPE为细胞收缩变圆，界限明显，间隙变宽，形成拉网状，细胞脱落.出现CPE，可初步判为病毒分离阳性.进一步鉴定采用实时荧光PCR或PCR等进行检测.
