中华人民共和国国家标准
GB/T 34799-2017
几丁质酶活性检测方法
Determination of the activity of chitinase
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.
本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、四川省卫生和计划生育监督执法总队、深圳市职业技术学院.
本标准主要起草人：李碧芳、赖心田、卢杰、张世伟、周李华、刘冬、林霖、唐栋、王士峰、陈血建、刘斌、杨国武.
几丁质酶活性检测方法
1范围
本标准规定了黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、灰色链霉菌（Streptomyces griseus）和绿色木霉（Trichodermaviride）发酵生产的儿丁质酶活性检测方法.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
几丁质酶活性单位chitinase activity unit
在37C，pH6.0时，通过β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶辅助的两步反应，每分钟催化生成1mgN-乙酰葡萄糖的儿丁质酶量为一个活力单位，单位为U.
4原理
几丁质酶能迅速催化儿丁质水解为N-乙酰葡萄糖或由N-乙酰葡萄糖构成的双糖和寡糖，双糖和寡糖在βN-乙酰氨基葡萄糖苷酶的辅助下继续水解为可由吸光度法检测的N-乙酰葡萄糖，通过外标法计算N-乙酰葡萄糖生成量测得酶活性.
5仪器设备及器具
5.1pH计：0.01级.5.2电子天平：感量0.0001g.5.3分光光度计：吸光度值精确至0.001. 5.41cm石英比色Ⅲ.5.5恒温震荡摇床：控温精度土0.5℃.
6试剂
本标准所使用的试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682中规定的二级水.
6.1溶液A：200mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0
磷酸氢二钾0.459g.磷酸二氢钾2.36g，加人90mL水，用1mol/L的氢氧化钾或盐酸调节pH至6.0，定容至100mL.
6.2溶液B：12.5mg/mL几丁质悬浊液
称取粉末状儿丁质5.0g，缓慢加人200mL（≤4C）预冷的37%的盐酸中，在磁力搅拌器上刷烈搅拌，待几丁质基本上溶解完毕且溶液变为清亮的黄色时，于4℃冰箱沉淀过夜.将上清液倒人2000mL的水中，搅拌，儿分钟后儿丁质沉淀，溶液变得混浊，30min后停止搅拌，将悬浮液置于4C冰以上.将上述沉淀物加到50mL的水中，刷烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质悬浊液.取该悬浊液 箱沉淀过夜.倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，至滤液pH达到5.55mL，105℃烘箱干燥至衡重，测定所制备的儿丁质悬浊液浓度.该悬浊液可于4℃放置3个月，临用前剧烈震荡摇匀，用溶液A稀释至12.5mg/mL.
6.3溶液C：2.5mol/L酒石酸钾钠溶液
100℃水浴加热，不可直接煮沸. 称取28.22g四水酒石酸钾钠（KNaCH:O;4HO），加人40mL的2mol/L氢氧化钠溶液.
6.4溶液D：96mmol/L3.5-二硝基水杨酸溶液
称取1.1g的35-二硝基水杨酸（3，5-DinitrosalicylicAcid），加人50mL水、100C水浴加热溶解，不可直接煮沸.
6.5溶液E：显色试剂溶液
缓慢搅拌将溶液C和溶液D混匀.用水稀释到100mL.若未完全溶解，试剂应该在混匀时溶解.试剂置于棕色瓶中，室温保存稳定保存6个月.
6.6溶液F：10mmol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷溶液（PNP-NAG）
称取342.3mg对硝基苯-N-乙酰-3-D-氨基葡萄糖苷（p-NitrophenylN-Acetyl-β-D-Glucosaminide PNP-NAG) 用水定容至 100 mL
6.7溶液G：β-N-乙酰葡胺苷酶溶液
用溶液A配置β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-Acetylglucosaminidase）的溶液，现用现配，并按以下方法调整酶浓度：试剂使用前在37C恒温箱中平衡30min.取1yL3-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶溶液加人1.25mL溶液A中，再加人1.25mL溶液F，快速混匀后于分光光度计400nm波长下，测定初始时和37C恒温反应10min后的吸光度值，两者之差即为△A.调整酶浓度至△A在0.16~0.20之间.
6.8溶液H：0.5mg/mLN-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液
称取0.05g的N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-D-Glucosamine，NAG），用水定容至100mL.
7分析步骤
7.1试验液的制备
7.1.1固体样品待测酶液制备
称取10mg样品，精确至0.1mg，加人溶液A至固体样品完全溶解并适当稀释，使得最后的溶液中含有0.8U/mL~1.0U/mL的酶活力.
7.1.2液体样品待测酶液制备
将液体酶样适当稀释，使得最后的溶液中含有0.8U/mL~1.0U/mL的酶活力.
7.2酶促反应
液B.0.2mL水，盖紧离心管，涡旋震荡，使儿丁质保持悬浊状态.样液处理管和空白对照管在37℃ 取2只离心管，其中样液处理管加入0.8mL溶液B，0.2mL试验液.空白对照管加入0.8mL溶反应2h.反应结束后，100C水浴终止反应，冷水浴冷却到37℃，每管中加人0.16mL的溶液G.37C涡旋震荡反应30min.离心后取上清.
7.3分光光度分析
取8只离心管，分别标记为0号～5号管、样液测试管和空白测试管.0号～5号管用于绘制标准曲线，加样方法如表1所示.样液测试管加人0.5mL样液处理管上清液，1.0ml水，0.75mL溶液E.空白测试管取0.50mL空白对照管上清，1.0mL水，0.75mL溶液E.100C水浴5min.结束后冷却到室温，在540nm处测吸光度值，记录每管的Asm
表1标准曲线加样方法
溶液 0号管 1号管 2号管 3号管 4号管 5号管溶液H/ml 0 0 0 1 0.2 0.3 0.4 0.5水/mL 1.5 1.4 1 3 1 2 1.1 1 0溶液E/ml 0 75 0.75 0 75 0 75 0.75 0 75
8结果计算
8.1标准曲线
别为 0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg、0.25mg.以1号~5号管对应的 N-乙酰葡萄糖量为横坐 1号~5号管△Am为其Aso与0号管A的差值.1号~5号管对应的N-乙酰葡萄糖量分标，△A为纵坐标，采用最小二乘法拟合线性回归方程.样品的△A为样品测试管A与空白测试管A的差值.通过标准曲线计算生成的N-乙酰葡萄糖的量m.
