中华人民共和国国家标准
GB/T35808-2018
Method for analysis of forestry biomass-Determination of cellulase activity
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由国家林业局提出.本标准由全国林业生物质材料标准化技术委员会（SAC/TC416）归口.本标准起草单位：北京林业大学、厦门标普标准化服务有限公司. 本标准主要起草人：赵宏飞、张柏林、常建民、周方、任学勇、许金飞
林业生物质原料分析方法 纤维素酶活性测定
1范围
本标准规定了在给定条件下与纤维素酶活性测定方法有关的术语和定义、原理、试剂和材料、仅器与设备、标准曲线绘制、试样制备、测定步骤、结果计算、重复性要求、试验报告.
本标准适用于林业生物质原料分析用纤维素酶活性的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验用水规格和试验方法
GB/T30366-2013生物质术语
3术语和定义
GB/T30366-2013中的一些术语和定义. GB/T30366一2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件.为了便于使用，以下重复列出了
3.1
林业生物质forestry biomass
Y、锯末、木屑、梢头、板皮和截头、果壳和果核等采伐剩余物和加工剩余物、造纸废弃物以及废弃木材）、 林业生产和加工过程中产生的生物质.主要包括林产品（如木材、竹材、藤材等）、林业剩余物（如枝能源林等.
[GB/T30366-2013 定义2.1.3]
3.2
纤维素酶活力单位cellulase activity unit
当于1pmol葡萄糖的还原糖量，为一个酶活力单位（U）.
4原理
纤维素酶在一定温度和pH条件下，水解羧甲基纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内酶解产生的还原糖的量与反应液的吸光值成正比，利用比色法测定还原糖生成量就可以 计算纤维素酶的活力.
5试剂和材料
5.1本标准所使用的试剂若无特殊说明，均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水.
GB/T 35808-2018
5.2氢氧化钠溶液（200g/L）：称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL.5.3葡萄糖标准贮备溶液制备（10mg/mL）：称取于105C土2C下烘干至恒重的无水葡萄糖1g，精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL.5.4柠棕酸溶液（0.1mol/L）：称取一水柠檬酸21.01g，加水溶解定容至1000mL.5.6柠檬酸盐缓冲液（0.05mol/L.pH5.5）：称取一水柠檬酸10.5g，加人氢氧化钠5.0g，溶于约 5.5柠檬酸钠溶液（0.1mol/L）：称取二水柠橡酸钠29.41g.加水溶解定容至1000mL.800mL水中，用柠檬酸溶液（5.4）或柠檬酸钠溶液（5.5）调节pH至5.5，再用水定容至1000mL.5.7羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液（5g/L）：称取甲基纤维素钠（Sigma-C5678）0.50g，加人柠檬酸盐缓冲液（5.6）80mL，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠全部溶解，然后停止加热，继续揽置，有效期为3d.5.83，5-二硝基水杨酸试剂：称取3 5-二硝基水杨酸（DNS）3.15g，置于约500mL水中，在50C水浴钠2.5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤.贮存于棕色试剂瓶中，避光
处放置7d后使用，有效期为6个月.
6仅器与设备
6.2pH计：精确至0.01.6.3磁力搅拌器：附加热功能.6.5离心机. 6.4电磁振荡器.6.6恒温水浴锅.6.7秒表：每小时误差不超过58.6.9移液器：精确度为1pl. 6.8分光光度计.6.10植物粉碎机：配有2mm筛孔的植物粉碎机.6.11分样筛：孔径为0.25mm（60目）.
6.1分析天平：感量为0.0001g
7标准曲线绘制
分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00 mL、2.00 mL4.00mL、6.00 mL 8.00 mL、10.00mL、12.00 mL、14.00mL，分别用柠檬酸盐缓冲液定容至100mL，配制成浓度为0.00mg/mL~1.4mg/mL的葡萄糖标准溶液.
分别吸取葡萄糖标准溶液各1.00mL于刻度试管中，各加2.00mL水和2.00mLDNS试剂.置于沸水浴中煮沸5min.取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL，在波长540nm处测量吸光度值，以标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，以对应吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程.
8试样制备
固体样品用植物粉碎机粉碎，然后过0.25mm（60目）筛，称取试样2份，精确至0.0001g，加人40mL柠檬酸盐缓冲液，磁力搅拌30min.再用柠橡酸盐缓冲液定容至100mL，4°C避光放置24h.摇匀，取30mL~50mL，以3000r/min离心3min，取上清液备用.
液体样品直接用柠橡酸盐缓冲液进行稀释定容.
9测定步骤
吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min.
吸取10.0mL经过甲基纤维素钠溶液，37℃平衡10min.
在25mL刻度具塞试管中.准确加人1.00mL甲基纤维素钠溶液（5.7），再依次加人2.00mlDNS试剂，0.5mL酶液，5mL水，电磁振荡3s，置于37C水浴中，准确计时，反应60min，然后放入沸水浴中加热5min，冷却至室温，用水定容至25mL.540nm波长处测量吸光度A..
在25mL刻度具塞试管中，准确加人1.00mL骏甲基纤维素钠溶液，再依次加人0.5mL酶液，5mL水，电磁振荡3s，置于37C水浴中，准确计时，反应60min，加2.00mLDNS试剂，然后放入沸水浴中加热5min，冷却至室温，用水定容至25mL.540nm波长处测量吸光度A1
10结果计算
试样纤维素酶活力按下列公式计算：
式中：
X 纤维素酶活力，单位为酶活力单位每克（U/g）或酶活力单位每毫升（U/mL）；M 葡萄糖摩尔质量，180.2g/mol； 根据标准曲线方程计算出（A-A）值对应的葡萄糖质量，单位为毫克（mg）：酶解反应时间，单位为分（min）；1 000转化因子，1mmol=1 000μmol;酶活力计算结果表示到小数点后三位. -试样的总稀释倍数.
11重复性
相对偏差不超过20%. 每个试样取两份试料进行平行试验，测定结果用其算术平均值表示.同一试样两个平行测定值的
12试验报告
试验报告至少应给出以下几个方面的内容：
a）样品信息：试验或测试样品的名称、种类、尺寸、数量、取样信息等；b）所使用的标准（包括发布或出版年号）：c）所使用的试验方法； d）结果；e）观察到的异常现象；f）试验人员、日期.
