中华人民共和国国家标准
GB/T 36853-2018
Detection and identification of Pseudomonas syringae pv.lachrymans
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黄岛出入境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中国农业科学院生物技术研究所、南京农业大学.
本标准起草人：田茜、夏明星、赵文军、栗智平、黄迎波、李为民、胡白石、田艳丽.
黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了黄瓜细菌性角斑病菌的样品制备、分离培养、免疫学及分子生物学等检测方法.本标准适用于可能携带黄瓜细菌性角斑病菌的黄瓜种子、植株及其产品的检疫鉴定.
2黄瓜细菌性角斑病菌基本信息
中文名：黄瓜细菌性角斑病菌、黄瓜角斑病菌
学名：Pseudowonas syringae pv. lachrymians (Smith &. Bryan） Young Dye &. Wilkie 1978
异名: Bacillas lachrymans (Smith &. Bryan) Holland 1920 Bacterium bargeri (Potebnya)Burgvits 1935 Bacteriam lachrymans Smith &. Bryan 1915 Chorobacter fachrymans (Smith &. Bryan) Patel &. Kulkarni 1951 Phytomoas fachrymans (Smith &. Bryan) Bergey et al. 1923 Psendomonas burgeri (Potebnya) Korobko &. Nikiforuk 1972 Pseucfomonas Iachryorans (Smith &. Bryan)Carsner 1918 Pseudomonas lachrymans f. cucumis Gorlenko 1961
英文名：Cucurbit angular leaf spot
分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），Y-变形菌纲（Gammaproteobacteria），假单胞菌目（Pseudomonadales），假单胞菌科（Pseudomonadaceae），假单胞菌属（Pseudomonas）.
传播途径：带菌种子是病原菌远距离传播的主要方式，病原菌由气孔、伤口、水孔侵人寄主，通过灌混水、风雨、气流、昆虫及农事操作等在田间传插蔓延.
黄瓜细菌性角斑病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
根据黄瓜细菌性角斑病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测；根据黄瓜细菌性角斑病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测；根据黄瓜细菌性角斑病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围 及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定.
4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备及用具
PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、制冰机、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统.
4.2主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯.分子生物学检测所需试剂见附录B和附录C.
营养琼脂（NA）培养基配制方法：牛肉浸膏3.0g，蛋白陈5.0g，酵母膏1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂15.0g，加双蒸水至1000mL 调节pH至7.0，混热灭菌（121℃，15min）.
5田间观察检测
5.1症状观察
对大田及保护地种植黄瓜进行调查，参照附录A中的症状描述观察有无黄瓜细菌性角斑病的症状，对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机采样.
5.2现场检测
采用商品化免疫胶体金试纸条进行现场检测按照操作说明进行检测及结果判定.
6实验室检测鉴定
6.1样品制备
6.1.1植株样品
对于有症状样品，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象，若有溢菌现象，选取新鲜组织（叶片、茎秆、果实）上的病健交界处（对于无症状样品，随机选取植物组织），在75%乙醇或含有效氯1%的次氯酸钠溶液中表面消毒50s~60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养Ⅲ中，加5滴~10滴无菌水，用灭菌镊子或剪刀将病组织接碎，静置5min~10min，即制成组织悬浮液，用于分离培养、免疫学检测及分子生物学检测.
6.1.2种子样品
对于种子样品，随机抽取待检种子300g左右，平均分成3份～5份，用微型粉碎机轻微破碎（至2/3以上种子破碎），加人适量pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液或生理盐水，使种子完全浸没，室温振荡 4 h（108 r/min），4C侵泡过夜.将浸泡液1 000r/min离心1min，去沉淀，上清液10 000 r/min 离心10min，弃上清液，取沉淀，用无菌水悬浮，制成1mL~2mL样品悬浮液，用于分离培养、免疫学检测及分子生物学检测.
6.2免疫学检测
采用商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定.
6.3分子生物学检测
6.3.1模板制备
对于植株或种子样品，按照6.1的方法制备成样品悬浮液后直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA，一20C保存备用.
液，一20℃保存）作为分子生物学检测反应模板. 对于纯培养菌株，可直接或经裂解处理后（97C沸水浴10min；12000r/min离心10min，取上清
根据实验室条件，可选择下列任一方法（6.3.2或6.3.3）进行检测.
6.3.2PCR凝胶电泳检测
2 对于种子、叶片等样品，以已知带菌的黄瓜种子或植物组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模
拟带菌方式代替），以健康的黄瓜种子或植物组织为阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行 PCR凝胶电泳检测.对于纯培养菌株，以Pseudomonas syringae pv.lachrymans 标准菌株做阳性对照，用非Pseudomonas syringaepv.lachrymans 的植物细菌做阴性对照，以双蒸水代答模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录B
6.3.3实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测具体步骤见附录C，对照设置同6.3.2.
6.4分离培养鉴定
对于植株样品，按照6.1.1的方法制备成组织悬浮液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在NA培养基平板上划线分离，重复3次.
对于种子样品，按照6.1.2的方法制备成样品悬浮液后，用无菌水进行10倍梯度稀释3次，各取100pL稀释液在NA培养基上涂板，或直接用灭菌接种环取样品悬浮液在NA培养基平板上划线分离，各重复3次.
将培养Ⅲ平板置于26℃恒温培养48h~72h后观察是否有直径1mm~1.5mm，白色，有光泽，圆形，边缘整齐的可疑菌落产生，挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3次，随后进行致病性测定以及免疫学或分子生物学鉴定（6.2或6.3）.
6.5致病性测定
使用无菌水将纯培养的菌株配制成10²CFU/mL的细菌悬浮液，采用金刚砂摩擦法接种或刺伤喷雾法接种在预先培育的4叶期健康黄瓜植株上，每一菌株接种3株～5株，用无菌水接种作对照，接种后保湿24h，在（24土2）℃，光周期为16h条件下培育，第3天始观察记录发病情况.
7结果判定
7.1植株样品
对于有典型症状植株样品免疫学或分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出黄瓜细菌性角斑病菌.无症状植株样品，免疫学或分子生物学检测结果阳性，经分离培养及致病性测定为阳性，即判定为 检出黄瓜细菌性角斑病菌.
7.2种子样品
对于种子样品的直接检测，免疫学或分子生物学检测为阳性，初步判定为检出黄瓜细菌性角斑病菌，若分离培养及致病性测定为阳性，则确定种子样品检出具有活性的黄瓜细菌性角斑病菌.
8样品及资料保存
8.1样品及菌种保存
样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出黄瓜细菌性角斑病菌的样品应保存于4C冰箱中，以备复核.该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理.从检测样品中分离并鉴定为黄瓜细菌性角斑病菌的菌株，应妥善保存，可采用甘油保存或冻干保存.对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理.
