中华人民共和国国家标准
GB/T 34800-2017
蛋白酶K酶活力及杂质检测方法
Detection method of activity and impurity of proteinase K
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
本标准由中国标准化研究院提出并归口.
本标准起草单位：东营瑞达生物科技有限公司、中国标准化研究院、中国生物技术发展中心、河北农业大学、浙江工商大学、合肥工业大学、河北省出人境检验检疫局、泉州市标准化研究所、北京市食品科 学研究院、河北食品检验研究院、河南大学.
本标准主要起草人：方存林、马爱进、苏月、孙纪录、王彦波、郑磊、刘道亮、林清山、孙勇、云振宇、博玲琳、赵琳、吴琦、周魏、康文艺、陈新凯.
蛋白酶K酶活力及杂质检测方法
1范围
本标准规定了蛋白酶K检测原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤和结果分析.本标准适用于生化试剂蛋白酶K产品的生产和检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T34222核糖核酸酶活力检测方法GB/T34801脱氧核糖核酸酶活力检测方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
蛋白酶Kproteinase K
能水解天然角蛋白（keratin）的一种丝氨酸蛋白酶.
注：按产品形态分为国态和液态.
3.2
注：一个酶话力单位以U表示. 在57C和pH8.0条件下，在1min内水解牛血红蛋白产生1pmol酚基氨基酸的酶量.
4原理
水解牛血红蛋白底物产生含有酚基的氨基酸：在碱性条件下，可将福林（Folin）试剂还原，生成钼蓝与钨 蛋白酶K可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂.它在57℃和pH8.0条件下，蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比.通过在680nm测定其吸光度，得到水解产生的酚基氨基酸的量，进而计算蛋白酵K酶活力.
5仪器设备及器具
5.1恒温水浴锅：精度为土0.1℃.5.2pH计：精度为0.1pH单位.5.4 1cm比色m. 5.3分光光度计：波长范围380nm~780nm，吸光度值精确至0.001.
GB/T 34800-2017
5.5电子天平：精度为0.0001g、0.01g和0.1g.5.6高速离心机：最小离心力为8000g，具1.5mL离心管.
6主要试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特殊说明外，实验用水均为GB/T6882规定的二级水.
6.10.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCI） pH8.0
称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.11g，加人适量水使其溶解，定容至100mL，用浓盐酸调至pH8.0，即成1mol/LTris-HCl缓冲液.再取1mL1mol/LTris-HCI缓冲液，加水定容至100mL.即成0.01 mol/L Tris-HC1缓冲液.
6.20.4mol/L三氯乙酸溶液
称取三氯乙酸65.40g，用水溶解并定容至1000mL.
6.31 mol/L HCi溶液
取8.50mL浓盐酸加人到50mL水中稀释，然后定容至100mL，得1mol/LHCI溶液.
6.40.1mol/LHCI溶液
取10.00mL 1mol/L HC1溶液加水定容至100mL 得0.1mol/LHCI溶液.
6.51%牛血红蛋白溶液
准确称取牛血红蛋白（BR，分子质量64.5kD）1.000g，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HC1缓冲液溶解，并定容至100mL.此溶液在4C冰箱贮存，有效期为3天.
6.60.4mol/L碳酸钠溶液
称取无水碳酸钠42.40g.用水溶解并定容至1000mL.
6.7福林（Folin）试剂
于2000mL磨口回流装置加人钨酸钠（NaWO2H O)100.0g、钼酸钠（NaMoO2H O）25.0g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL.小火沸腾回流10h.取下回流冷却器，在通风橱中加人硫酸锂（LiSO）50g、水50mL和数滴浓溴水.再微沸15min，以除去多余的溴，至冷却后无绿色.加 水定容至1000mL.混匀，过滤.试剂应呈金黄色.贮存于棕色瓶内，避光保存.使用时，用1份福林试剂与2份水混匀，制成稀福林试剂.也可将商品化福林试剂按照产品使用指南稀释成稀福林试剂.
6.8100μg/mLL-酪氨酸标准溶液
称取纯度≥95%的L-酪氨酸0.1000g，105C干媒至恒重，用20mL1mol/LHC1溶液溶解后，再用水定容至100mL，即为1mg/mLL-醛氨酸标准储备溶液，在4C冰箱贮存.临用前，吸取1mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准溶液.
7分析步骤
7.1核糖核酸酶（RNase）酶活力
按GB/T34222进行检测.
7.2脱氧核糖核酸酶（DNase）酶活力
按GB/T34801进行检测、
7.3蛋白酶K酶活力
7.3.1标准曲线绘制
按表1，在10mL容量瓶中配制L-酪氨酸标准工作溶液.
表1L-酪氨酸标准工作溶液配制
酪氨酸标准工作溶液 100μg/mL酪氨酸管号 的浓度/（(μg/mL) 标准溶液/ml. 水/ml.0 0 0 0 00 10 001 10 0 1 00 9 002 20 0 2 00 8 003 30 0 3 00 7 005 4 50 0 40 0 4 00 5 00 5 00 6 006 60 0 6 00 4 00
分别吸取L-酪氨酸标准工作溶液1.0mL于具塞试管中，每个浓度作2个平行，然后加入5.0mL碳酸钠溶液和1.0mL稀福林试剂，混匀.将标准管同时置于40C水浴，反应20min，取出，用冷水迅 速冷却至室温，用分光光度计，在680nm波长下，以不含酪氨酸的0号管为空白，用1cm比色Ⅲ，测定吸光度（A）.
以吸光度A为纵坐标，以L-酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，此线应通过零点.得出线性回归方程和回归系数（R²）.回归系数在0.9990及以上时，方可使用，否则应重做.
新配制的福林试剂应制作新的标准曲线.
7.3.2固体待测样品制备
称取0.0050g固体酶，精确至0.0001g，用0.01mol/L pH8.0的Tris-HC1缓冲液溶解，并稀释至酶浓度曲线中呈线性关系的酶浓度范围内.
7.3.3液体待测样品制备
吸取100pL液体酶，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至酶浓度曲线中呈线性关系的酶浓度范围内.
7.3.4测定
取3支10mL具塞试管，样品空白管1支，样品管2支，分别向3支试管中准确加人稀释好的待测酶液1.0mL，在57C下水浴预热5min.向2支样品管中加入1.0mL经同样预热的1%牛血红蛋白溶液，准确计时反应10min：迅速、准确地向3支试管中加人2.0mL0.4mol/L三氯乙酸溶液：于样品空 白管中加入1.0mL1%牛血红蛋白溶液，混匀.3支试管继续在57C下水浴10min，取出，迅速冷却至室温，11 000 g 离心 5 min
