中华人民共和国国家标准
GB/T 35338-2017
Detection and identification of Cadophora gregata（Allington&D.W.Chamb.）T.C.Harr.&McNew
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：陈枝楠、王念武、杜洪忠、王颖、吴品珊、程颖慧、汪莹、章桂明、李芳荣.
大豆茎褐腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了大豆茎褐腐病菌的检疫鉴定方法.
本标准适用于大豆茎褐腐病菌的寄主携带大豆茎褐腐病菌的检疫鉴定.
2病菌的基本信息
学名:Cadophora gregara (Allington &. D.W. Charmb.) T.C. Harr. &. McNew
异名： Cephalosporium gregatum Allington &. D.W. Chamb. Phialophora gregata (Allington &.D.W. Chamb.) T.C Harr.&.McNew
分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Asycota），散囊菌網（Eurotiomycetes），刺盾复目（Chae-tothyriales) Herpotrichiellaceae
大豆茎褐腐病菌有2个寄主专化型，即大豆茎褐腐病菌大豆专化型C.gregataf.sp.xojae和大豆茎褐腐病菌赤豆专化型C.gregata f.sp.adzakicola，二者在形态和生理特征上没有明显区别，主要为DNA序列和寄主的差异，赤豆茎褐腐病菌侵染赤豆不侵染大豆，面大豆茎褐腐病菌侵染大豆不侵染赤豆.根据DNA序列和症状上的差异，大豆茎福腐病菌大豆专化型C.gregata f.sp.sojae 又被分成两种基因型A型和B型.
传播途径：大豆茎褐腐病菌主要通过其寄主植物茎秆残体进行远距离传播.
大豆茎褐腐病菌的其他信息参见附录A，序列信息参见附录B.
3方法原理
根据大豆茎褐腐病菌的培养性状、形态学特征和分子生物学特征为判断依据.
4仪器和器具
4.1仪器
主要使用的仪器包括：生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、摇床.
4.2器具
片、盖玻片、塑料研栋、移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐. 主要使用的器具包括：烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养Ⅲ、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻
5试剂和培养基
5.1试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯.
GB/T 35338-2017
主要使用的试剂包括：琼脂粉、马铃薯、葡萄糖、乳酸、琼脂糖、无菌双蒸水、液氮、硫酸铜、五氯硝基苯、次氯酸钠、琼脂糖、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化镁、盐酸、乙二胺四乙酸四钠盐、氢氢化钠、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、十六烷基三甲基澳化铵、三羟甲基氨基甲烷乙酸缓冲液、无水乙醇、苯酚、氯仿、异丙醇、异戊醇、蛋白酶K、PCR缓冲液、TagDNA聚合酶、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP dGTP) DNA 分子量 Marker PCR 引物 BSRIGS1 和 BSRIGS2
5.2培养基
本方法所用的培养基参见附录C.
6检疫鉴定方法
6.1症状检查
田间大豆植株上选择叶片有不同程度萎、褪绿的植株，切开植株茎秆部位，观察茎秆内部是否有褐变.大豆种子中主要挑选其夹带的茎秆残体，切开茎秆检查内部是否福变.具体症状参见附录A.
6.2分离培养
将疑似大豆茎秆或茎秆残体，在病健交界处剪取小块2mm~5mm，用0.5%次氯酸钠表面消毒2min~3min，灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸将水吸干后，置于选择性培养基PGM平板上，20C黑暗培养，3d~5d后开始观察.
6.3形态学鉴定
如在选择性培养基上观察到真菌菌落的形成，转接到GBA和PDA培养基上，20℃黑暗培养，5d后开始观察记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生孢子的形状和大小.
6.4分子生物学鉴定
6.4.1DNA提取
收集病残体或分离到的真菌菌丝，CTAB法提取核酸，参见附录D.
6.4.2PCR特异性检测
特异性引物 BSRIGS1和 BSRIGS2的序列（引自 Chen Weidong et al，2000）分别为 5′-GGGGT-TCCGGGATTCACAGG-3′和 5'-GAGTGGTAAATGGGGTAATCAAC-3'
2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL 10 μmol/L Primers 各 0.5 μL 5 U/μL Taq DNA polymerase 0.2 μL 反应体系（25μL）:样品DNA1μL，10×PCRbuffer2.5μL，2.5mmol/LMgCL:2.5μLddH;O 15.3 μL
以灭菌去离子水作空白对照，以大豆茎褐腐病菌的DNA作为阳性对照，以大豆上其他病菌的DNA作为阴性对照，每个样品重复2次.
反应条件：94℃3 min、55℃C1min、72℃2 min;94C45s55℃45s、72℃1min 40个循环；72 C 5 min.
在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，EB染色，凝胶成像仪分析结果.
7鉴定标准
7.1菌落特征
在PGM培养基上，菌落白色至暗褐色，浅黄色最为常见，菌落表面隆起，光滑或粗糙.在PDA培养基上，菌落扇平，白色到浅黄色.在GBA培养基上菌落为白色，菌丝紧贴培养基.
7.2病原形态
在PDA培养基上很少产生分生孢子，而在GBA培养基上20C下培养15d会有分生孢子产生.大豆茎褐腐病菌的分生孢子卵形至椭圆形，无色，单胞偶尔形成有分隔的细胞，平均大小为（3.4pμm~7.6pm）×（1.7μm~3.4pm）.分生孢子梗具有瓶梗状结构，无色，无隔膜或有隔膜，大小为（4μm~ 15 μm）×（2μm~3μm），呈桶型或长颈瓶型，有清晰的领饰.菌丝无色，有隔膜，直径1.2μm~4.7μm.分生孢子可聚集在分生孢子梗顶端的黏滴内，形成不规则的假头状.
7.3PCR特异性产物
性PCR特异性扩增产物片段大小为1020bp，大豆茎福腐病菌大豆专化型基因型B或大豆茎褐腐病菌 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，大豆茎褐腐病菌大豆专化型基因型A定赤豆专化型定性PCR特异性扩增产物片段大小为830bp.
8结果判定
病菌的培养性状和形态特征与7.1和7.2的描述一致，且PCR扩增出现1020bp或830bp的片段，则可判定为大豆茎褐腐病菌.如果PCR特异性扩增产物片段大小为1020bp，则为大豆茎福腐病菌大豆专化型基因型A：若扩增产物片段大小为830bp，则为大豆茎褐腐病菌大豆专化型基因型B或病菌赤豆专化型，可对PCR产物进行测序. 大豆茎褐腐病菌赤豆专化型，如要进一步区分是大豆茎褐腐病菌大豆专化型基因型B还是大豆茎褐腐
9样品和档案保存
9.1样品保存与处理
保存6个月以备复核，该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理. 样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出大豆茎褐腐病菌的样品应保存于6℃冰箱中，至少
9.2菌株保存与处理
面上，20C培养5d.10C黑暗条件下保存，定期（60d）转接防止病菌死亡，至少保存6个月.保存期满 从检测样品中分离并鉴定为大豆茎褐腐病菌的菌株，应妥善保存，将菌株接种于PDA培养基斜后高压灭菌灭活处理.
9.3结果记录与资料保存
审核人员签字. 完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和
