中华人民共和国国家标准
GB/T35024-2018
Detection method of mammals and poultry ingredients-Suspendedbead array
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、韩建勋、刘鸣畅、王斌、黄文胜、曹际娟、王娉、张舒亚、高宏伟.
常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法
1范围
本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法.
种常见肉品或掺杂成分（骆驼、马、驴、耗牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠）动物物种成分的定 本标准适用于肉及加工品、乳、皮张、内脏、动物饲料等畜禽产品中哺乳动物和反当动物成分，和13性检测.方法的最低检出限为（质量百分比）：水牛5%，哺乳、反当、狗、羊、鸡、大鼠、小鼠为1%，骆驼、耗牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为0.1%.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T3561国境口岸卫生监督食品采样、送样规程
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1
液相芯片技术suspended bead array
通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合，通过流式细胞技术对样品中的多种目标成分进行同时检测.
3.1.2
液相芯片探针suspended array Probe
固定于微球表面，能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子.
3.1.3
质控探针quality control probe
用来监控芯片反应是否正常的探针.
注：本标准使用的是人工合成的一段寡核背酸探针（polyT：polyAS端氨基标记）.
3.1.4
荧光强度中位值medianfluoresence intensity
液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值，即软件自动读取与样品结合的微球数量，并进行背最值校正后得到的数值.
3.1.5
阅值cutoff value
判定阳性信号的最低荧光强度中位值.通过实验数据统计分析后得出，要求防止假阳性结果，同时保证灵敏度需求.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件：CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid) dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate)dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate)dGTP：脱氧鸟甘三磷酸（deoxyguanosine triphosphate)dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate） EDC：1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminodipropyl）-N-ethylcar-bodimade]EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)MES;2-吗林乙磺酸[2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid] SA-PE：链霉亲和素-藻红素（streptavidinphycoerythrobilin)SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticu）TE：由 Tris 和 EDTA 配制面成的缓冲溶液（Tris-EDTA buffer solution)TMAC：四甲基氧化铵（tetramethylammonium chloride) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]
4方法提要
对样品中的靶基因进行PCR扩增，通过液相杂交将偶联探针的微球与PCR扩增产物结合，采用流式细胞技术对目标成分进行检测.每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针，特异结合一种目标核酸序列，该核酸序列连接荧光标记物，单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测，一束PCR产物与相应微球进行反应：检测多种成分时，可以将各个成分的PCR产物与微球混合物进行反 激光检测微球的色标编码，另一束激光检测目标核酸序列荧光标记物.检测单一成分时，将该成分应.检测实验室需达到GB/T27403-2008的要求.
5检测用引物和探针
质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针，反当动物通用引物探针，以及13种特异性引物和探针序列参见附录A中表A.1
6试剂
6.1TaqDNA聚合酶.6.210×PCR缓冲液.6.3 dNTPs (dATP dCTP dGTP dTTP). 6.4琼脂糖.2
6.5溴化乙锭.6.6酚.6.7三氯甲烷.6.9无水乙醇. 6.8异丙醇.6.10异戊醇.6.11分子量标准品（最小片段≥20bp，最大片段≤2000bp）.6.13电泳缓冲液（10×TBE：Tris 54 g，硼酸 27.5 g 20 mL 0.5 mol/L EDTA Tris-HCl pH 8.0 加水 6.12TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HC1 pH 8.0，1 mmol/L EDTA).至 1 000 mL;50×TAE:Tris 242 g 100 mL 0.5 mol/L EDTA pH 8.0 冰乙酸，57.1 mL 加水至 1 L).6.15非磁性微球（微球直径5.6μm，羧基修饰，按比例掺人660nm和730nm两种分类荧光染色，每 种荧光有10种浓度，根据比例不同可以把球型基质分类为100种）.6.160.1 mol/L MES 溶液.6.19 0.1% SDS. 6.180.02% Tween-20.6.20 SA-PE溶液.6.21TMAC溶液（5 mol/L TMAC 20% N-月桂酰肌氨酸，1mol/L Tris-HCl pH 8.0 0.5mol/L6.22 CTAB 提取液(20 g/L CTAB 1.4 mol/ L NaC1 0.1 mol/1L Tris-HC1 0.02 mol/L Na; EDTA pH 8 0) EDTA pH 8.0).6.23除另有规定外，试剂均为分析纯.实验用水符合GB/T6682中二级水的要求.
6.14加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）.6.17EDC溶液（10 mg/mL).
7仪器设备
7.1PCR仪.7.3恒温箱. 7.2液相芯片仪.7.4离心机：离心力15000g.7.5微量移液器：0.5 μL~10 μL，10 μL~100μL，20 μL~200μL200μL~1 000 μL7.6核酸蛋白分析仪. 7.7天平：感量0.01mg.
8样品采集与制备
8.1样品采集与前处理
样品分成三等份，包括检样、复检样和贮存样. 采样、送样要求应符合GB/T14699.1和SN/T3561的规定.按照8.1~8.2进行前处理，处理后的
8.2肉、皮张、内脏等
净50mL离心管或干净密封袋中，冻存于-20℃. 先依次用70%乙醇和ddHO冲洗2次～3次，洗去外源成分和调料等，控干水分，搅碎，收集到干
8.3乳、饲料等
混匀后直接分装到干净50mL离心管或干净密封袋中，根据样品种类贮存于一20C或4℃.
